猪轮状病毒VP融合蛋白重构体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108359015A(43)申请公布日2018.08.03(21)申请号201810271984.5C12N1/21(2006.01)(22)申请日2018.03.29A61K39/15(2006.01)A61P31/14(2006.01)(83)生物保藏信息C12R1/19(2006.01)CCTCCNO：M20180472018.01.19(71)申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学(72)发明人徐进平姚帅(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)42222代理人彭劲松(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书12页C12N15/62(2006.01)序列表2页附图4页(54)发明名称猪轮状病毒VP融合蛋白重构体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了猪轮状病毒VP融合蛋白重构体及其制备方法和应用。本发明提供的融合蛋白VP8-VP7-TAT，包括猪轮状病毒（PRV）外衣壳结构蛋白VP4的截断片段VP8和VP7及结合在其C端的TAT蛋白转导肽碱性氨基酸富集区的11个核心氨基酸。将融合蛋白VP8-VP7-TAT通过腹腔注射或口服灌胃的方式免疫小鼠，可有效诱导机体产生体液免疫应答和粘膜免疫应答，具有良好的免疫原性。因此，本发明将猪轮状病毒蛋白VP8、VP7与TAT融合表达，为预防PRV感染提供了一种新的方法，也为猪轮状病毒新型口服疫苗的开发奠定了基础。CN108359015ACN108359015A权利要求书1/1页1.一种猪轮状病毒VP融合蛋白重构体VP8-VP7-TAT，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的融合蛋白重构体VP8-VP7-TAT对应的的核苷酸序列，其特征在于：编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种含有融合蛋白VP8-VP7-TAT基因的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：其分类命名：EscherichiacoliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)，大肠杆菌BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)，保藏编号：CCTCCNO:2018047。4.权利要求1所述的融合蛋白VP8-VP7-TAT的制备方法，包括步骤如下：1)、获得含有VP8、VP7基因及TAT转导肽基因的重组表达质粒pGEX-VP8-VP7-TAT：人工合成重组基因VP8-VP7-TAT基因片段，其序列为SEQIDNO.1所示，VP8-VP7-TAT基因片段和质粒载体pGEX-6p-1分别经EcoRI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳，胶回收，最后将目的片段连接在pGEX-6p-1载体上，连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经鉴定，得到的阳性重组子即为含有VP8-VP7-TAT基因的大肠杆菌，即构建了质粒pGEX-VP8-VP7-TAT；2)、大肠杆菌工程菌的制备：将重组表达质粒pGEX-VP8-VP7-TAT转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到的阳性转化子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性的菌落即为能表达融合蛋白VP8-VP7-TAT的重组基因工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)，大肠杆菌BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)，即E.coliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)；3)、融合蛋白VP8-VP7-TAT的制备：将重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)的单菌落接种于含100μg/mlAmp的20mlLB液体培养基中，37℃摇床过夜培养10-12h；第二天，取1ml菌液转接到100ml含100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃摇床培养3h，到菌液OD值约为0.6时，加IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，于37℃摇床250rpm诱导表达4-5h。将菌液4℃，12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；用适量PBS缓冲液洗涤菌体，并用加入适量溶菌酶的细胞裂解液重悬菌体，300W超声破碎20min，8000rpm离心20min；破碎后的沉淀经8M尿素变性后4℃，8000rpm，离心10min，收集上清；按GST-Resin纯化步骤纯化融合蛋白VP8-VP7-TAT，得到纯化的融合蛋白VP8-VP7-TAT之后，进行复性透析后，获得具有生物学活性的基因工程融合蛋白VP8-VP7-TAT；融合蛋白VP8-VP7-TAT序列为SEQIDNO.2所示。5.权利要求1所述的融合蛋白重构体VP8-VP7-TAT，其特