一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113072638A(43)申请公布日2021.07.06(21)申请号202110279177.X(22)申请日2021.03.16(71)申请人宁波博睿瀚达生物科技有限公司地址315048浙江省宁波市高新区星光路211号021幢2层202室(72)发明人朱文瑾李浛君陈平李浛民(74)专利代理机构宁波市鄞州盛飞专利代理事务所(特殊普通合伙)33243代理人王玲华洪珊珊(51)Int.Cl.C07K14/815(2006.01)C07K1/18(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法(57)摘要本发明涉及生物医药的分离纯化技术领域，具体涉及一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。本发明根据重组水蛭素和内毒素在中性条件下与阴离子交换剂吸附作用的强弱，通过增加流动相中的盐浓度进行等度洗脱，通过进样量的调控来实现良好的去除效果，保证了较高的蛋白回收率，同时实现了色谱柱的再生，该方法简单、高效、成本低，适用于工业化生产。CN113072638ACN113072638A权利要求书1/1页1.一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。2.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基键合硅胶为固定相。3.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，平衡液、洗脱液和再生液均为pH值为6.5～7.5的缓冲液。4.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，洗脱液和再生液均为含NaCl的Tris‑HCl缓冲液，且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度。5.根据权利要求4所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，洗脱液中，NaCl的浓度为100～150mmol/L，Tris‑HCl的浓度为8～20mmol/L。6.根据权利要求4所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，再生液中，NaCl的浓度为1.0～2.0mol/L，Tris‑HCl的浓度为8～20mmol/L。7.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，平衡液为浓度为8～20mmol/L、pH值为6.5～7.5的Tris‑HCl缓冲液。8.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，重组水蛭素蛋白溶液为对重组水蛭素发酵液进行纯化制得，纯度≥90％。9.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，重组水蛭素洗脱液中，100μg重组水蛭素中内毒素含量≤0.25EU/ml。2CN113072638A说明书1/5页一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法技术领域[0001]本发明涉及生物医药的分离纯化技术领域，具体涉及一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法。背景技术[0002]水蛭是我国传统中药，始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀、痛经之功效。从水蛭唾液腺里提取的水蛭素是一种抗凝血蛋白质，其对凝血酶具有极强的抑制作用，可用于抑制纤维蛋白原和血小板在损伤血管内的积累、预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血等疾病。相比肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物，水蛭素具有用量小、疗效高、不良反应少、安全性高等优点，具有很好的临床应用价值。[0003]天然水蛭素是由65‑66个氨基酸残基组成的单链环肽化合物，分子量约为7000Da，其中N末端有3对二硫键，可绕叠成密集的环肽结构，其疏水结构域与凝血酶催化中心附近的非极性结合点互补，对蛋白质起稳定作用，而C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。由于水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO3‑，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。[0004]最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌