一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115611972A(43)申请公布日2023.01.17(21)申请号202211237544.0C07K1/20(2006.01)(22)申请日2022.09.30C07K1/34(2006.01)C07K1/36(2006.01)(71)申请人西安德诺海思医疗科技有限公司地址710000陕西省西安市沣东新城科源三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单元1层B单元2层B单元3层(72)发明人郝东侯增淼赵硕文魏文培周浩李敏乔莎张立峰崔雪君(74)专利代理机构深圳市精英专利事务所44242专利代理师李莹(51)Int.Cl.C07K14/435(2006.01)C07K1/14(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法(57)摘要本发明公开了一种重组类贻贝粘蛋白内毒素的去除方法，涉及生物蛋白纯化技术领域。该方法包括：S1，向被内毒素污染的蛋白制剂中加入含有尿素与氯化钠的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上样料液；S2，用缓冲液平衡好层析柱，将所述上样料液过柱，收集穿柱料液；S3，向穿柱料液中加入盐酸，进行酸热反应；S4，对S3反应完的料液调节pH值至大于或等于3.0，经透析过滤浓缩收集截留液，得到内毒素含量小于或等于5EU/mg的产物。本发明提供的去除方法在去除目标蛋白内毒素的同时，能够获得较高的目标蛋白回收率，具有简单、高效的优点，可进行大批量工业化生产。CN115611972ACN115611972A权利要求书1/1页1.一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，向被内毒素污染的蛋白制剂中加入含有尿素与氯化钠的混合溶液，使蛋白充分溶解，得到上样料液；S2，用缓冲液平衡好层析柱，将所述上样料液过柱，收集穿柱料液；S3，向穿柱料液中加入盐酸，进行酸热反应；S4，对S3反应完的料液调节pH值至大于或等于3.0，经透析过滤浓缩收集截留液，得到内毒素含量小于或等于5EU/mg的产物。2.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S1中，混合溶液中的尿素含量大于或等于4.0mol/L，氯化钠含量为1.5～2.0mol/L。3.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S1中，上样料液中含有的重组类贻贝粘蛋白含量为15～20g/L。4.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述缓冲液为1.5～2.0mol/L的氯化钠溶液。5.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述层析柱为苯基疏水层析柱。6.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S3中，加入盐酸至0.05～0.15mol/L。7.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S3中，酸热反应的温度为80℃及以上，反应时间0.5～1h。8.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述被内毒素污染的蛋白制剂包含部分纯化的重组类贻贝粘蛋白；或者所述被内毒素污染的蛋白制剂包含高度纯化的重组类贻贝粘蛋白。9.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S4中，过滤方式为超滤。10.如权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法，其特征在于，所述步骤S4中，还包括对截留液进行冷冻干燥。2CN115611972A说明书1/6页一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法技术领域[0001]本发明涉及生物蛋白纯化的技术领域，尤其涉及一种重组类贻贝粘蛋白内毒素去除方法。背景技术[0002]贻贝粘蛋白(musseladhesiveprotein，MAP)是贻贝足部分泌腺分泌出的一种蛋白复合物，具有促进细胞贴壁爬行、促进创面愈合、抑制瘙痒、广谱粘接、形成抗水保护膜等作用。近年来因其具有高强度，高韧性，防水性和可降解性等优点收到了广泛的关注，在生物医药方面得到了大力的推广和应用。[0003]贻贝粘蛋白的获取途径主要为海洋紫贻贝足部提取，受原材料及提取工艺的限制，获取贻贝粘蛋白纯品的效率及产量较低，极大得限制了贻贝粘蛋白的应用，利用生物技术手段进行重组类贻贝黏蛋白的发酵生产成为现下的研究重点。[0004]现有技术中，利用生物技术获取的大肠杆菌工程菌发酵表达纯化最终获得重组类贻贝粘蛋白冻干产品的报道日益增多，但冻干产品或纯化产品中内毒素高且去除困难，极大地限制了其产品在医疗器械领域的使用，[0005]内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸3