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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114163517A(43)申请公布日2022.03.11(21)申请号202111560397.6C07K1/14(2006.01)(22)申请日2021.12.20C07K1/18(2006.01)(71)申请人西安德诺海思医疗科技有限公司地址710000陕西省西安市沣东新城科源三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单元1层B单元2层B单元3层(72)发明人郝东周浩魏文培赵硕文侯增淼(74)专利代理机构深圳市精英专利事务所44242代理人谭穗平(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页(54)发明名称一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法(57)摘要本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法,涉及生物工程技术领域;本发明首次采用复合阳离子交换填料pH梯度洗脱达到一步去除内毒素并获取高纯度目标蛋白的效果,在精细纯化过程中采用pH值7.0~7.5的磷酸盐缓冲液作为流动相B1,可将杂蛋白及内毒素洗脱干净;采用经碱试剂调节pH值至8.0~8.5的注射用水作为流动相B2,既可洗脱目标蛋白,又避免了采用常规含氯化钠缓冲液洗脱目标蛋白的弊端,在后续纯化步骤中无需进行长时间的脱盐过程,且得到的产品中目标蛋白含量较高,极大的简化纯化工艺,缩短纯化时间,是一种理想的大规模生产重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法。CN114163517ACN114163517A权利要求书1/1页1.一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将重组人源化胶原蛋白发酵液在搅拌下加热至80~85℃并保持20~30min;(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机离心固液分离,去除菌体及高温变性杂蛋白,收集上清液,所得上清液用0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清,滤出液用碱试剂调节pH值至5.5~6.0,用纯化水调节溶液电导率至6.5~7mS/cm;(3)将步骤(2)所得的滤出液经复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化,洗脱过程采用流动相B1洗脱内毒素及杂质,流动相B2洗脱重组人源化胶原蛋白,洗脱液经冷冻干燥即可得重组人源化胶原蛋白;所述流动相B1为pH值7.0~7.5的磷酸盐缓冲液;所述流动相B2为用碱试剂调节pH值至8.0~8.5的注射用水。2.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液采用注射水配制。3.根据权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的浓度为5~15mmol。4.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,步骤(2)或步骤(3)中,所述碱试剂为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁。5.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,步骤(3)中,所述复合型弱阳离子交换层析柱为采用流动相A平衡后的复合型弱阳离子交换层析柱。6.根据权利要求5所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述流动相A为pH值5.5~6.5的磷酸盐缓冲液。7.根据权利要求6所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的浓度为5~15mmol。8.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述复合型弱阳离子交换层析柱的填料为MMCBestaroseFF。9.根据权利要求8所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法,其特征在于,所述MMCBestaroseFF填料的平均粒径为90μm。10.一种重组人源化胶原蛋白,其特征在于,采用权利要求1‑9任一项所述的纯化和内毒素去除方法制备而得,所述重组人源化胶原蛋白的内毒素含量低于0.05EU/mg。2CN114163517A说明书1/6页一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法。背景技术[0002]胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质,约占蛋白质总量的25%~33%,其广泛分布于集体各个组织器官,如皮肤、骨骼、角膜、血管等,尤其在人体的皮肤和结缔组织中,含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质,对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有重要作用。重组胶原蛋白以其天然的止血、低毒性、低抗原型、低免疫性、能引导细胞再生和与人体相容性较好等优点,而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。[0003]在现有技术中,重组胶原蛋白的层