一种重组蛋白内毒素的去除方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115386562A(43)申请公布日2022.11.25(21)申请号202211067526.2C07K1/36(2006.01)(22)申请日2022.09.01(71)申请人江苏丰华生物制药有限公司地址224001江苏省盐城市大丰区高新技术区五一路1号(72)发明人张慧君邵恒张文学陈太标花亚东(74)专利代理机构江苏盐城世拓专利代理事务所(普通合伙)32526专利代理师陈翠翠(51)Int.Cl.C12N9/72(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/14(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种重组蛋白内毒素的去除方法(57)摘要本发明涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法，其中的高效去内毒素亲和填料FF可以特异性的去除病毒、核酸和蛋白等与重组蛋白结合的内毒素，且其载量较高，稳定性较好不会有脱落，重组蛋白回收率高，从而有效的降低了处理成本；同时，本发明所采用的方法操作简单，不需要对高效去内毒素亲和填料FF进行装柱，使用方便，可以根据重组蛋白中所含的内毒素总量加入，容易进行工艺放大，采用本发明的方法对注射用替奈普酶进行纯化处理后，注射用替奈普酶纯度大于98％，内毒素＜0.6eu/mg，收率大于90％，产品的质量得到了极大的提升。CN115386562ACN115386562A权利要求书1/1页1.一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将待处理的细胞上清液进行预处理，得到预处理液；步骤2：将所述预处理液经BlueSepHarose6FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysineHyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；以及，步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶。2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤1中采用0.45滤器对所述待处理的细胞上清液进行预处理。3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤2中洗脱液A的组分为：10‑50mM磷酸盐缓冲液、0.043％聚山梨酯20、0.5‑1M氯化钠、2‑4M尿素、5‑10mg/L抑肽酶。4.根据权利要求3所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述洗脱液A的pH值为7.2‑8.0，其用量是柱体积的3‑5倍。5.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤3中洗脱液B的组分为：0.2‑1.0M精氨酸、0.1‑0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6‑10mg/L抑肽酶、5‑18mg/ml磷酸。6.根据权利要求5所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述洗脱液B的pH值为7.4‑7.8，其用量是柱体积的3‑5倍。7.根据权利要求1或4或6所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF的吸附载量为10000‑14000eu/mL。8.根据权利要求7所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF在使用前需要使用平衡缓冲液C对其进行处理。9.根据权利要求8所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述平衡缓冲液C的组分为：1％脱氧胆酸钠，10‑50mM磷酸盐缓冲液。10.根据权利要求9所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述平衡缓冲液C的pH值为6.8‑7.4，用量为所需处理的填料体积的5‑10倍。2CN115386562A说明书1/5页一种重组蛋白内毒素的去除方法技术领域[0001]本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法。背景技术[0002]内毒素是一种对人类或动物产生有害影响的热原，因而在生物制品中内毒素的浓度必须低于安全、受管制的水平，故在生产过程需要对生物制品中的内毒素进行去除。内毒素的去除方法有很多，例如超滤法、活性炭吸附法、相分离法、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和吸附法(即在填料表面偶联如多粘菌素B、组胺、组氨酸以及一些聚阳离子等具有特异性结合作用的配位基，从而可以选择性吸附与其可发生特异性结合的物质)，此外还包括金属离子鳌合层析和氢氧化铝吸附法。[0003]其中注射用替奈普酶目前多采用BlueSepHarose6FastFlow亲和层析、lysineHyperD亲和层析两步层析方法进行纯化，两步亲和层析对杂质去除效果较好，且纯化后蛋白纯度、收率较好；但