一种生产重组水蛭素的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108220369A(43)申请公布日2018.06.29(21)申请号201711262810.4C07K14/815(2006.01)(22)申请日2017.12.04C12R1/19(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNo.09082003.03.19(71)申请人广东双骏生物科技有限公司地址515071广东省汕头市汕头保税区C03地块双骏生物科技园(72)发明人陈杰鹏段丽丽洪琳陈煜藩陈鸿锐邱雪莲蔡桂珠胡留松许志锴叶红林黄晓莹纪烨瑜(74)专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人陈丹苏蕾(51)Int.Cl.C12P21/02(2006.01)权利要求书2页说明书13页附图2页(54)发明名称一种生产重组水蛭素的方法(57)摘要本发明公开了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCCNo.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，首先在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养，该升温过程是在1小时内完成，可选地在10分钟内完成，还可选地在5分钟内完成。CN108220369ACN108220369A权利要求书1/2页1.一种生产重组水蛭素的方法，其特征在于，包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCCNo0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值；可选地继续培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值；可选地在30℃的温度下培养至对数生长期结束，可选地升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长。2.根据权利要求1所述的方法，其中升温过程是在1小时内完成，可选地在10分钟内完成，还可选地在5分钟内完成。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种，可选地，所述碳源物质为蔗糖，或所述碳源物质为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氮源物质选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种，可选地，所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者，或所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比为0.2-40：1，可选地为1.1:1。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基还包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合，可选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种；可选地，所述镁盐为硫酸镁或氯化镁；可选地，所述钠盐选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基还含有抗生素物质，可选地，所述抗生素物质为氨苄青霉素；可选地，所述抗生素物质分两次加入发酵培养基中，其中第一次加入是在接种时且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前；还可选地，所述抗生素物质的第二次加入是以流的形式进行添加。9.根据权利要求1所述的方法，其中以1％-20％的接种量将所述pBH-2工程菌(保藏号：CGMCCNo0908)接种至所述发酵培养基，可选地以15％的接种量接种。10.根据权利要求1所述的方法，其中菌株培养初始pH值为5.5-11，可选6.5-8.0。11.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：对菌株发酵液进行灭活处理，灭活温度60℃-80℃，可选75℃；灭活时间为5min-20min，可选10min；任选地，灭活处理后的菌株发酵液经0.1～1μm孔径的陶瓷膜进行固液分离，纯化水水洗，收集陶瓷膜透析液，陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜浓缩，向浓缩后的浓缩液加重量比为5％-30％的盐进行喷雾干燥。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基的组成物质可以分两次加入，其2CN108220369A权利要求书2/2页中第一次加入是在接种前加入，第二次加入是于接种后以流的方式加入且在13小时内完成。13.根据权利要求8所述的方法，其中所述以流的方式进行添加是指将流速控制在每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.017mg/L-0.33mg/L的抗生