一种基于SF的外泌体分析方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114137100A(43)申请公布日2022.03.04(21)申请号202111263995.7(22)申请日2021.10.28(71)申请人中科新生命（浙江）生物科技有限公司地址322015浙江省金华市义乌市稠江街道杨村路高创园10号楼1-2楼(72)发明人陈薇曾秋芳庞悦涵(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人黎允仪(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种基于SF的外泌体分析方法(57)摘要本发明提供一种基于SF的外泌体分析方法，属于生物技术检测领域，其在样本蛋白提取的过程中使用可酸性条件下分解的表面活性剂，进行蛋白提取，继而对提取的蛋白进行液相色谱‑串联质谱分析，具有肽段回收率高，样品重复性好、高通量和可实现自动化的优点。CN114137100ACN114137100A权利要求书1/1页1.一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，其在外泌体蛋白提取的过程中添加可在酸性条件下分解的SF蛋白酶解表面活性剂，外泌体蛋白提取完成后对SF蛋白酶解表面活性剂进行分解，最后使用液相色谱‑串联质谱对外泌体蛋白进行分析。2.根据权利要求1所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：步骤S1，取血液外泌体样本加入SF蛋白酶解表面活性剂，SF蛋白酶解表面活性剂的终浓度是20％；步骤S2，对步骤S1中的外泌体样本进行破碎，破碎后离心，取上清液，即为外泌体蛋白；步骤S3，取外泌体蛋白依次进行还原处理和烷基化处理；步骤S4，烷基化处理后加入NH4HCO3溶液，使SF蛋白酶解表面活性剂在混合物中的浓度降低至2％；步骤S5，对外泌体蛋白进行酶解，酶解完成后加入TFA酸化至pH<3；步骤S6，对步骤S5最终获得的混合物进行冷冻干燥，并用FA复溶，测OD值，继而上样进行液相色谱‑串联质谱检测分析。3.根据权利要求2所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中对外泌体采用超声破碎，使用超声破碎仪，设定功率为80W，超声时间为10S，间歇时间为15S，工作次数为10次；外泌体破碎后，采用25℃20000g离心20min，取上清。4.根据权利要求3所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S3还包括步骤S31，采用BCA定量法对步骤S2中获得的外泌体蛋白进行定量分析。5.根据权利要求4所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的还原处理是向外泌体蛋白中加入二硫苏糖醇，800rpm震荡，室温孵育1h；烷基化处理是加入碘乙酰胺，800rpm震荡，避光室温孵育15min。6.根据权利要求5所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S5中酶解是先加入胞内蛋白酶，800rpm震荡1min，37℃孵育2h；再加入胰蛋白酶，37℃，反应8h。7.根据权利要求6所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S6中，液相色谱的条件是：色谱分析柱为25cm*75μm，填料c18为1.9um；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈浓度为84％；流动相A+流动相B＝100％；流速：300nl/min；液相分离梯度如下：0min—70min，b相线性梯度从2％到22％；70min—78min，b相线性梯度从22％到37％；78min—83min，b相线性梯度从37％到95％；83min—90min，b相线性梯度从95％维持至90min。8.根据权利要求7所述的一种基于SF的外泌体分析方法，其特征在于，所述的步骤S6中，质谱的条件是：采用正离子扫描模式，分析时长：90min，母离子扫描范围：100‑1700m/z,累积时间100ms，离子迁移率从0.6到1.6Vs/cm2，采集单次循环时间1.16s，DIA模式。2CN114137100A说明书1/4页一种基于SF的外泌体分析方法技术领域[0001]本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于SF蛋白酶解表面活性剂样本制备酶解的外泌体修饰蛋白质组学分析方法。背景技术[0002]2013年诺贝尔生理学或医学奖表彰了三位发现细胞内部囊泡(外泌体)的运输调控机制的科学家，也引发了科学家对外泌体研究的重新认识，广泛运用于疾病的生物标记物筛选、代谢疾病研究、肿瘤转移机制、免疫调控等领域。近年来，随着外泌体研究的不断深入，它的应用已经涉及肿瘤治疗领域、医学基础和免疫领域、寄生虫领域；临床研究上已涉及心血管系统、内分泌代谢系统等。[0003]目前的主流观点认为