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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109266613A(43)申请公布日2019.01.25(21)申请号201811155640.4(22)申请日2018.09.29(71)申请人中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)地址300020天津市和平区南京路288号(72)发明人郝牧宫达森魏晓晶邱录贵(74)专利代理机构天津欣达睿诚知识产权代理事务所(普通合伙)12216代理人李欣(51)Int.Cl.C12N5/09(2010.01)权利要求书2页说明书10页附图6页(54)发明名称一种外泌体分离制备方法(57)摘要本发明涉及一种外泌体分离制备方法,属于生物技术领域。一种外泌体分离制备方法,包括如下步骤:1)离心去除细胞杂质;2)离心去除细胞碎片和大的蛋白杂质;3)将上清转移到新离心管中,离心弃沉淀,留上清;4)过滤上清并转移;5)将试剂XBP与样品混合后转移到膜吸附柱中,离心,弃管底的液体;6)离心去除残留在膜上的液体;7)加入试剂XWP,离心,弃管底的液体,将柱子换到新的离心管中;8)将试剂XE加到柱子上,离心将外泌体洗脱,得到含有外泌体的液体。本发明提取的外泌体的RNA纯度提高,杂质少,可以减低起始提取外泌体的生物样本体积同时提高循环外泌体的得率。CN109266613ACN109266613A权利要求书1/2页1.一种外泌体分离制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1)离心去除生物样品中的细胞杂质;2)离心去除细胞碎片和大的蛋白杂质;3)将上清转移到新的1.5ml离心管中,4℃,12000g离心45min,弃沉淀,留上清;4)用0.2μm滤器过滤上清并转移到新的1.5ml离心管中;5)将试剂XBP与样品按照体积比1∶1的比例混合后转移到膜吸附柱exoEasyMidiSpinColumns中,500g离心1min,弃管底的液体;6)在3500g的条件下离心1min去除残留在exoEasyMidiSpinColumns膜上的液体;7)再向柱子exoEasyMidiSpinColumns中加入3.5ml试剂XWP,3500g条件下离心5min,弃管底的液体,将柱子换到新的离心管中;8)将400μl的试剂XE(QIAGENNo.160011905)加到exoEasyMidiSpinColumns上在3500g,5min的离心条件下将外泌体洗脱,得到含有外泌体的液体。2.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法,其特征在于:所述步骤1)离心去除生物样品中的细胞杂质是指将外周血或骨髓浆在4℃,2500g的条件下离心10min,去除红细胞,白细胞等细胞杂质的影响,弃除沉淀保留上清,将上清转移到新的1.5mlEP管中。3.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法,其特征在于:所述步骤2)离心去除细胞碎片和大的蛋白杂质是指将上清在4℃,2000g的条件下离心30min,去除细胞碎片和大的蛋白杂质,弃沉淀留上清。4.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法,其特征在于:所述试剂XBP、试剂XWP、膜吸附柱exoEasyMidiSpinColumns来源于试剂盒QIAGENexoRNeasySerum/PlasmaMidiKitscatNo:77044。5.根据权利要求1至4中任何一项所述的外泌体分离制备方法,其特征在于:所述生物样品为血液或骨髓浆。6.根据权利要求5所述的外泌体分离制备方法,其特征在于:所述生物样品为哺乳动物的生物样品。7.根据权利要求5所述的外泌体分离制备方法,其特征在于:所述哺乳动物为人。8.根据权利要求7所述的外泌体分离制备方法,其特征在于:还包括RNA提取步骤。9.根据权利要求8所述的外泌体分离制备方法,其特征在于,所述RNA提取步骤如下:(1)在含有外泌体的重悬液中加入700μlQIAzol;(2)将EP管涡旋5秒,15℃-25℃下静置5min后,加入90μl氯仿用力上下摇晃15s,室温静置2-3min;(3)12000g,4℃离心15min;(4)将上层水相转移到新的EP管中,避免吸到中间的有机层;(5)加入上层水相二倍体积的100%乙醇(如,400μl的上层水相应加入800μl100%乙醇),通过上下吹吸混匀,吸取700μl的液体加到柱子RNeasyMinEluteSpinColumn上,盖上盖子,8000g,离心15s,弃掉管底的液体;(6)用剩余的液体重复步骤(5),直至将所有的液体转移;(7)将700μl的bufferRWT加到柱子上,盖上盖子,8000g,离心15s,弃管底的液体;(8)将500μl的bufferRPE加到柱子上,盖上盖子,8000g,离心15s,弃管底的液体;2CN109266613A权利要求书2/2页(9)将500μl的bufferR