外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109321563A(43)申请公布日2019.02.12(21)申请号201811214590.2(22)申请日2018.10.18(71)申请人北京博奥晶典生物技术有限公司地址101111北京市大兴区北京经济技术开发区科创六街88号院10号楼101室(72)发明人王莹莹尹经逵陈军许俊泉(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅魏少伟(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N5/071(2010.01)C12Q1/6806(2018.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图5页(54)发明名称外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法(57)摘要本发明公开了外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法。本发明公开的构建外泌体小RNA文库的方法，包括：利用制备外泌体的方法得到外泌体；所述制备外泌体的方法包括：利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩，得到浓缩后的样品；提取所述浓缩后的样品中外泌体即得到外泌体；提取外泌体RNA，得到外泌体总RNA；利用所述外泌体总RNA制备得到外泌体小RNA文库。本发明不仅可以富积多种体液及细胞上清液中外泌体，并完成低起始量小RNA的建库。CN109321563ACN109321563A权利要求书1/2页1.构建外泌体小RNA文库的方法，包括：1)利用制备外泌体的方法得到外泌体；所述制备外泌体的方法包括：利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩，得到浓缩后的样品；提取所述浓缩后的样品中外泌体即得到外泌体；2)提取外泌体RNA，得到外泌体总RNA；3)利用所述外泌体总RNA制备得到外泌体小RNA文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有外泌体的液体为体液或细胞上清液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述体液为血液、血浆、血清、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、羊水或腹水。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩通过利用含有所述滤膜的超滤管进行。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心力为4000-5000×g；和/或，利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心时间为10-60分钟；和/或，利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体在4℃下进行。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：提取所述浓缩后的样品中外泌体包括a1)和a2)：a1)沉淀所述浓缩后的样品中的外泌体，得到混合液；a2)将所述混合液离心，使外泌体进入沉淀中，即得到外泌体。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a1)通过向所述浓缩后的样品中添加外泌体沉降剂完成；和/或，步骤a2)中所述离心的离心力为1500×g；和/或，步骤a2)中所述离心的离心时间为30min；和/或，步骤a2)中所述离心在4℃下进行。8.下述X1)或X2)的方法：X1)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法；X2)制备外泌体RNA的方法，包括：按照权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法得到外泌体，提取外泌体的RNA即得到外泌体RNA。9.成套产品，由下述Y1)或Y2)组成：Y1)权利要求1-4中任一所述截留分子量为3KD的滤膜或所述超滤管；Y2)权利要求7所述外泌体沉降剂。10.下述任一应用：Z1)权利要求1-7中任一所述构建外泌体小RNA文库的方法在外泌体小RNA测序中的应用；Z2)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在外泌体小RNA测序中的应用；Z3)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在构建外泌体小RNA文库中的应用；Z4)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在制备外泌体RNA中的应用；2CN109321563A权利要求书2/2页Z5)权利要求8中所述制备外泌体RNA的方法在外泌体小RNA测序中的应用；Z6)权利要求8中所述制备外泌体RNA的方法在构建外泌体小RNA文库中的应用；Z7)权利要求9所述成套产品在外泌体小RNA测序中的应用；Z8)权利要求9所述成套产品在构建外泌体小RNA文库中的应用；Z9)权利要求9所述成套产品在制备外泌体RNA中的应用；Z10)权利要求9所述成套产品在制备外泌体中的应用。3CN109321563A说明书1/10页外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域中，外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法。背景技术[0002]1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Jo