噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115745990A(43)申请公布日2023.03.07(21)申请号202211388260.1C07K16/44(2006.01)(22)申请日2022.11.08G01N33/53(2006.01)(71)申请人中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人金茂俊许灵媛曹振王静金芬佘永新郑鹭飞邵华王珊珊王淼(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师王立普(51)Int.Cl.C07D417/12(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)权利要求书3页说明书17页附图7页(54)发明名称噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用(57)摘要本发明首次提供了噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用，属于免疫分析技术领域。国内外有关噻嗪酮半抗原的结构设计和合成，抗体制备与免疫分析方法的建立均都尚处于研究空白。本发明提供的噻嗪酮半抗原可充分暴露噻嗪酮抗原决定簇于宿主动物免疫系统。本发明提供的完全抗原为由式I所示结构的化合物与载体蛋白偶联，得到噻嗪酮完全抗原。本发明制备的完全抗原被用于免疫宿主动物后，能够刺激机体产生高灵敏度的抗血清/抗体，制备得到的抗血清/抗体能够特异性识别噻嗪酮。本发明提供的抗血清/抗体可以用于建立噻嗪酮免疫学分析方法或检测试剂。本发明将为保障我国噻嗪酮在食品及农产品的残留提供强有力的技术支撑，具有广阔应用前景。CN115745990ACN115745990A权利要求书1/3页1.噻嗪酮半抗原，具有式I所示结构：式I中，R1为‑(CH2)n‑COOH、‑(CH2)n‑OH、‑(CH2)n‑NH2、‑(CH2)n‑COOR2、其中m、n独立地为0～6的整数；R2为2.权利要求1所述的噻嗪酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：将5‑甲基‑2‑吡咯酮、盐酸和水混合，进行开环反应，得到具有式a所示结构的化合物；将所述具有式a所示结构的化合物、甲醇和酯化反应催化剂混合，进行酯化反应，得到具有式b所示结构的化合物；将所述具有式b所示结构的化合物、叔丁基异硫酸酯、无机碱催化剂和第一有机溶剂混合，进行取代反应，得到具有式c所示结构的化合物；将所述具有式c所示结构的化合物、无机强碱水溶液和第二有机溶剂混合，进行水解反应，得到具有式d所示结构的化合物；将N‑甲基甲酰苯胺、磺酰氯、偶氮类引发剂和第三有机溶剂混合，进行酰氯化反应，得到具有式e所示结构的化合物；2CN115745990A权利要求书2/3页将所述具有式d所示结构的化合物、具有式e所示结构的化合物、无机强碱水溶液、相转移催化剂和第三有机溶剂混合，进行成环反应，得到具有式I‑1所示结构的噻嗪酮半抗原；将所述具有式I‑1所示结构的噻嗪酮半抗原、N‑羟基琥珀酰亚胺、碳酰二亚胺盐酸盐与第四有机溶剂混合，进行羧基活化反应，得到具有式I‑2所示结构的噻嗪酮半抗原；3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述开环反应的温度为95～100℃，时间为7.5～8h；所述酯化反应的温度为75～80℃，时间为5.5～6h；所述取代反应的温度为20～25℃，时间为9.5～10h；所述水解反应的温度为20～25℃，时间为5～5.5h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酰氯化反应的温度为70℃～回流温度，时间为2.5～3h；所述成环反应的温度为20～25℃，时间为8～8.5h。5.噻嗪酮完全抗原，包括权利要求1所述的噻嗪酮半抗原和与所述噻嗪酮半抗原偶联的载体蛋白。6.权利要求5所述的噻嗪酮完全抗原在制备噻嗪酮抗血清或噻嗪酮抗体中的应用。7.抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体，由权利要求5所述的噻嗪酮完全抗原乳化后免疫宿主动物得到。8.权利要求7所述的抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：将权利要求5所述噻嗪酮完全抗原乳化后免疫宿主动物；将免疫宿主动物加强免疫后，采集免疫动物的全血，对血清进行分离和纯化，得到抗噻嗪酮多克隆抗体；或者，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与SP2/0瘤细胞融合后，筛选能够分泌抗噻嗪酮抗体的单克隆杂交瘤细胞株，基于所述单克隆杂交瘤细胞株制备抗噻嗪酮单克隆抗体；或者，从宿主动物的外周血液中B淋巴细胞的IgG中提取mRNA用于纳米抗体文库的构建，在构建好的纳米抗体文库中进行纳米抗体的淘选，将淘选得到的纳米抗体的诱导表达3CN115745990A权利要求书3/3页和纯化后，得到抗噻嗪酮纳米抗体。9.检测噻嗪酮的试剂盒，包括权利要求7抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体或权利要求8