一种外泌体的分离提取方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115678840A(43)申请公布日2023.02.03(21)申请号202211430834.7(22)申请日2022.11.15(71)申请人陕西慧康生物科技有限责任公司地址710077陕西省西安市雁塔区鱼化工业园鱼跃路56号慧康生物科技产业园中试提纯车间楼9层东(72)发明人王鑫王瑞莉张忠旗翟江华李元(74)专利代理机构西安永生专利代理有限责任公司61201专利代理师高雪霞(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书6页附图2页(54)发明名称一种外泌体的分离提取方法(57)摘要本发明公开了一种外泌体的分离提取方法，该方法是将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，所得滤液过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，外泌体被多聚赖氨酸吸附，其他杂蛋白、脂类、盐从柱子穿过，通过洗脱液进行洗脱得到粗提的外泌体溶液；粗提的外泌体溶液再经过CD63‑CNBr‑Sepharose4B等层析柱精提，最后用100KD孔径的超滤膜超滤，获得纯度95％以上的外泌体。本发明方法无需超速离心，即可实现从培养上清和乳品等中提取高纯度外泌体，整个提取过程操作简单，稳定，容易操作，提取的外泌体结构完整、纯度高、回收率高，并且不需要复杂的仪器就能完成外泌体的提取。CN115678840ACN115678840A权利要求书1/2页1.一种外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤组成：(1)将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液；(2)将步骤(1)收集的滤液穿过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，再用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液；所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是将含‑COOH或‑NH2的阳离子树脂直接和多聚赖氨酸连接获得或者将含‑OH或‑COOH或‑NH2的阳离子树脂通过Linker和多聚赖氨酸连接获得；所述洗脱液为3～6mol/L尿素溶液、3～6mol/L盐酸胍溶液、3～6mol/L异硫氰酸胍溶液中任意一种；(3)将粗提的外泌体溶液穿过CD63‑CNBr‑Sepharose4B层析柱或CD81‑CNBr‑Sepharose4B层析柱或CD9‑CNBr‑Sepharose4B层析柱，再用盐酸‑甘氨酸洗脱层析柱，对外泌体进行进一步的精提；(4)将精提的外泌体溶液和PBS缓冲液等体积混合，然后用100KD孔径的超滤膜超滤，此过程重复3～5次，得到纯度95％以上的外泌体。2.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含外泌体的液体样品为牛奶、羊奶、人乳、细胞培养上清、尿液、血清中任意一种。3.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，步骤(2)中，先用1.5～2倍柱体积的20mmol/LpH＝7.35的PBS缓冲液平衡树脂柱，待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤(1)收集的滤液进行上样，上样量为1.5～2个柱体积，上样速度为0.5～3mL/分钟，上样结束后静置5～10分钟，用1～2个柱体积的20mmol/LpH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡树脂柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱树脂柱，然后静置5～10分钟，继续用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液。4.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述含‑COOH的阳离子树脂为羧基化硅胶、羧基化琼脂糖、羧基化葡聚糖中任意一种；所述含‑NH2的阳离子树脂为氨基化硅胶、氨基化琼脂糖、氨基化葡聚糖中任意一种；所述含‑OH的阳离子树脂为羟基化硅胶、羟基化琼脂糖、羟基化葡聚糖中任意一种。5.根据权利要求4所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是在缩合剂、添加剂的作用下，将含‑COOH的阳离子树脂与多聚赖氨酸的‑NH2通过缩合反应或含‑NH2的阳离子树脂与多聚赖氨酸的‑COOH通过缩合反应获得。6.根据权利要求5所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是：在缩合剂、添加剂的作用下，将含‑OH或‑NH2的阳离子树脂与两端均为‑COOH或一端为‑COOH、另一端为‑OH或‑NH2的Linker上一端的‑COOH进行缩合反应后，再将多聚赖氨酸的‑NH2与Linker上另一端的‑COOH进行缩合反应或多聚赖氨酸的‑COOH与Linker上另一端的‑OH或‑NH2进行缩合反应，得到多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂；或者所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是：在缩合剂、添加剂的作用下，将含‑COOH的阳离子树脂与两端均为‑OH或两端均为NH2或一端为‑OH、另一端为‑NH2的Linker上一端的‑OH或NH2进行缩合反应后，再将多聚赖氨酸的‑COO