一种细胞外泌体提取分离的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109666622A(43)申请公布日2019.04.23(21)申请号201910070512.8(22)申请日2019.01.25(71)申请人中国科学院上海高等研究院地址201210上海市浦东新区海科路99号申请人中国科学院大学(72)发明人丁润中(74)专利代理机构深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙)44248代理人吴肖敏(51)Int.Cl.C12N5/00(2006.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称一种细胞外泌体提取分离的方法(57)摘要本发明公开了一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；将收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；用一次性注射器吸取上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；将细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；使用PBS缓冲液对沉淀进行清洗重悬，将液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；使用PBS缓冲液重悬沉淀，即为所提取分离的外泌体产物。CN109666622ACN109666622A权利要求书1/1页1.一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后去除上清保留沉淀部分；S5：清洗重悬；使用PBS缓冲液将S4)中获得的沉淀进行清洗重悬；S6：再次超速离心：将S5)中获得的液体再次放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离心完毕后小心吸出上清保留沉淀部分；S7：重悬沉淀：使用PBS缓冲液将S6)中获得的沉淀进行重悬，即为所提取分离的外泌体产物。2.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：所述细胞培养基上清体积不少于30ml，细胞培养基上清内不含血清或使用不含外泌体的血清。3.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：S2)中沉淀包括细胞培养基内的死细胞以及大的细胞碎片成分，S4)中沉淀部分含有外泌体。4.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：S4)中进行超速离心前对所使用的超速离心管进行灭菌处理。5.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：S5)和S7)中所用PBS缓冲溶液为无菌中性溶液，且不含有不溶颗粒。6.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体提取分离的方法，其特征在于：S7)中所用PBS缓冲溶液使用体积为50ul，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。2CN109666622A说明书1/3页一种细胞外泌体提取分离的方法技术领域[0001]本发明涉及外泌体提取分离技术领域，具体为一种细胞外泌体提取分离的方法。背景技术[0002]目前细胞外泌体提取方法主要有超速离心法，密度梯度离心法，高聚物沉淀法以及免疫磁珠法等。现有的外泌体提取方法在操作性，成本，提取效率和产物纯度上难以做到平衡，通常操作简便，耗时较少的方法所提取的外泌体纯度难以保障。而能够获得高纯度外泌体的提取方法往往耗时长，操作复杂且需要昂贵设备支持。发明内容[0003]本发明的目的在于提供一种细胞外泌体提取分离的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种细胞外泌体提取分离的方法，包括以下操作步骤：[0005]S1：细胞培养基上清:将目标细胞放入选定的培养基内，细胞培养后72h收获，离心获取细胞培养基上清；[0006]S2：低速离心：将S1)中收获的细胞培养基上清使用低温离心机进行4℃，6000xg离心30min，离心完毕后将离心管内上清液转移至新管备用，沉淀丢弃；[0007]S3：滤膜过滤：用一次性注射器吸取将S2)中获得的上清液，将上清液缓慢滴至规格为0.22um的细胞滤膜进行过滤；[0008]S4：超速离心：将S3)中获得的细胞培养基放入超速离心机进行4℃，100000xg超速离心70min，离