一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106124282A(43)申请公布日2016.11.16(21)申请号201610595164.2(22)申请日2016.07.26(71)申请人广州海力特生物科技有限公司地址510535广东省广州市广州高新技术产业开发区开源大道11号A7栋二层(72)发明人王通崔毅峙罗彦彰郭嘉慧(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人谭英强(51)Int.Cl.G01N1/34(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法(57)摘要本发明公开了一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法。用于分子生物学及临床检验技术领域。包括分离提取外泌体的叠层离心过滤装置、孵育缓冲液和蛋白酶K组成的分离提取外泌体试剂盒。利用试剂盒中的孵育缓冲液以及适量蛋白酶K在室温下孵育待测样品，然后利用本发明的叠层离心过滤装置在配套的离心机中离心，混匀，收集超滤管中的截留液即可得到外泌体。本发明方法无需离心机以外的大型实验设备，价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作，所获高纯度外泌体能够满足临床大规模推广应用的需求。CN106124282ACN106124282A权利要求书1/1页1.一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：包括过滤管、套在过滤管外侧的超滤管和套在超滤管外侧的废液收集管，所述过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，所述过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，一级过滤管腔和二级过滤管腔均通过通气道与外界连通。2.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：所述滤膜的孔径不大于1μm。3.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤膜为截留分子量为30-100kDa颗粒的超滤膜。4.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤管于过滤管下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔，至少一个平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。5.一种分离提取外泌体的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的叠层离心过滤装置、孵育缓冲液和蛋白酶K。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240mMTris、60-180mMEDTA，pH为7-7.5。7.一种分离提取外泌体的方法，其特征在于，包括下列步骤：1）在待测样品中加入0.1-5倍体积的孵育缓冲液，并加入适量蛋白酶K，充分混匀，室温孵育；2）将步骤1）处理完的样品转移至权利要求1-4任一项所述的叠层离心过滤装置的过滤管中，将叠层离心过滤装置放入离心机中离心，混匀，收集超滤管中的截留液得到外泌体。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240mMTris、60-180mMEDTA，pH为7-7.5。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1）中，加入适量蛋白酶K，使其终浓度为0.2mg/mL-2.0mg/mL。10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：步骤2）中离心时，离心力不超过5,000×g，离心时间为10-30min。2CN106124282A说明书1/8页一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学及临床检验领域，具体涉及一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法。背景技术[0002]外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，具脂双层膜结构，大小约为30–150nm，广泛分布于体液中；可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs及信号分子等具生物学活性的物质；具较强靶向性，易与靶细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至靶细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。[0003]目前外泌体的提取方法主要可归纳为以下几种：超速离心法、多聚物沉淀法、磁珠法和超滤法。[0004]一、超速离心法是目前应用最广的外泌体