外泌体提取方法总结.doc

细胞培养上清:即在4℃下,首先30０×g离心1０mｉn,吸取上清液,然后20０0×g离心1０mｉn;吸取上清液后,１０００0×ｇ高速离心３0min,吸取上清液;１4００0０×g超速离心90mｉｎ;除去上清液,所获得的沉淀即为外泌体.用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140０00×g再次离心９0mｉｎ,100μLPBＳ缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。将小鼠或人血收集在1.５mL管中,并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。此后，将其以2，00０×g离心持续１0分钟获得血清。接着将血清以３,000×ｇ离心１0分钟。将上清液以无菌PBS以１:１的比例稀释并离心再次以１０,0０0×g保持３０分钟,然后以2０0,0０0×ｇ进行2小时超速离心。将颗粒在ａ中洗涤大量ＰBＳ，通过0。2—μｍ注射器过滤器过滤,并以200,0００×ｇ离心1小时,然后收集沉淀并重悬于PＢS或ＰBS中用于后期功能或生化测定的培养基。为了从体液(例如尿液,支气管肺泡灌洗液，血清,血浆，肿瘤腹水)中纯化外泌体,只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝,血清的话不抗凝直接离心。在4°Ｃ下在玻璃瓶中储存长达５天,直至进行外泌体纯化．外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同,但由于某些流体的粘度，必须稀释它们,并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体(Ｃａｂｙ等，2００５)．基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体(例如，血浆：通过Ficolｌ离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液,细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水(ＰＢＳ;附录)2Ａ）冷冻离心机５0毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置(如Ｓｔeritoｐ，Ｍｉlliｐorｅ）超速离心机和固定角度或摆动式转子(见表3.22。1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶(见表3。22)0。１）注意：所有离心均应在4℃下进行。1。用等体积的PBＳ稀释液体．将稀释的液体转移到5０毫升管中．在2,00０×g，4℃下离心３0分钟。２。将上清液转移到超速离心管或瓶中,没有颗粒污染(参见基本方案1，步骤3注释）.在１2，０0０×g，4℃下离心４5分钟。3。小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中(根据处理的液体体积,可参见表３.22.1中的管）.在１10,０00×ｇ,４℃下离心2小时。４．将沉淀重悬于1ｍlPBＳ中,并将其在其中一个管中汇集。用ＰBS填充管以大量稀释再悬浮液。5.通过０。22—μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。６。在110，00０×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。7.将沉淀重悬于１mｌＰＢS中,然后用ＰBS填充管．在110,０0０×g,４℃下离心70分钟。倒出上清液。8。将沉淀重悬于50至20０μｌＰBＳ中。在—80℃下储存长达1年。