一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927422A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210812447.3(22)申请日2022.07.12(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人姜建国谢珊蓉陈浩宏梁明华戴聚良吴婧璇(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245专利代理师张珍(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用。本发明质粒是以pACCRT‑EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来得到。本发明的克隆质粒不仅有抗性基因作为筛选基因，还插入了一段还插入了一段CrtE、CrtI、CrtB序列，该序列的存在可以使大肠杆菌呈现红色，因此在使用该发明进行克隆时，克隆成功菌落则为白色，否则呈现红色，可以通过直观的颜色变化有效减轻阳性菌的筛选工作量。CN115927422ACN115927422A权利要求书1/2页1.一种用于无缝克隆的质粒，其特征在于：是通过将CrtE、CrtI、CrtB序列依次克隆到常规质粒中得到，CrtE、CrtI、CrtB序列两端含有相同的ⅡS型限制性酶位点；其中，CrtE序列如SEQIDNO.1第3124位～第4032位碱基所示，CrtI序列如SEQIDNO.1第4217位～第5695位碱基所示，CrtB序列如SEQIDNO.1第5691位～第6621位碱基所示。2.根据权利要求1所述的用于无缝克隆的质粒，其特征在于：所述的ⅡS型限制性酶为BsaI、BsmBI或BbsI。3.根据权利要求1或2所述的用于无缝克隆的质粒，其特征在于：所述的质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求1‑3任一项中所述的用于无缝克隆的质粒的构建方法，其特征在于：按照SEQIDNO.1所示序列进行人工合成，或以pACCRT‑EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来；其中：用于扩增片段1的引物如下：pDTK001Part1‑F：5’‑AAGCGGTCTCCTGAcACGTTGATCGGCACGTA‑3’pDTK001Part1‑R：5’‑AAGCGGTCTCCAcACGAAAAACATATTCTCAATAAACC‑3’用于扩增片段2的引物如下：pDTK001Part2‑F：5’‑AAGCGGTCTCGGTgTCAGCCAATCCCTGGGTGA‑3’pDTK001Part2‑R：5’‑AAGCGGTCTCGtcgccgaGCGTGCTGCTAGCGCTATA‑3’用于扩增片段3的引物如下：pDTK001Part3‑F：5’‑AAGCGGTCTCGgcgagacgCATAGTGACTGGCGATGCT‑3’pDTK001Part3‑R：5’‑AAGCGGTCTCGcagagacgTGTAGGCATAGGCTTGGTTATG‑3’用于扩增片段4的引物如下：pDTK001Part4‑F：5’‑AAGCGGTCTCGtctgaccGCATCCAGGGTGACGGTG‑3’pDTK001Part4‑R：5’‑AAGCGGTCTCGgTCATTTTCGCCAAAAGTTGGC‑3’。5.权利要求1‑3任一项中所述的用于无缝克隆的质粒在无缝克隆中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的应用包括如下步骤：(1)目的DNA分子PCR引物设计：用于GoldenGate反应的目的DNA分子PCR引物设计原则如下：正向引物：5’‑保护碱基‑ⅡS型限制性酶识别序列‑任意碱基‑切割位点‑插入片段正向特异引物序列F‑3’；反向引物：5’‑保护碱基‑ⅡS型限制性酶识别序列‑任意碱基‑切割位点‑插入片段反向特异引物序列R‑3’；(2)使用目的DNA分子PCR引物对目的基因进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行分离回收；(3)将经过纯化回收的PCR产物与所述的用于无缝克隆的质粒、ⅡS型限制酶、T4DNA连接酶混合，进行GoldenGate反应；(4)反应结束后，转化普通感受态细胞；使用氯霉素抗性进行筛选后，选择白菌落进行PCR鉴定并测序，获得目标重组质粒。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的DNA分子PCR引物设计原则中，保护碱基的碱基数目为4‑8个；切割位点的碱基数2CN115927422A权利要求书2/2页目为3‑8个。8.根据