一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820812A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211197375.2(22)申请日2022.09.29(71)申请人齐鲁工业大学地址250353山东省济南市长清区大学路3501号(72)发明人郭英姝吴谛(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师苏士莹(51)Int.Cl.C12Q1/6841(2018.01)C12Q1/6886(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒(57)摘要本发明属于检测技术领域，具体涉及一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒。本发明提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，利用红细胞膜囊泡(RVs)与细胞外囊泡(EVs)进行膜融合的创新策略，在不破坏EVs的膜囊泡结构的同时将荧光检测探针递送进去，实现在限域空间中荧光探针局部浓度的明显增加，进而导致探针间碰撞的机率急剧增加，使得对靶标的检测灵敏度升高。本发明检测的荧光强度与miRNA‑21浓度在50pM‑40nM范围内存在良好的的线性关系。CN115820812ACN115820812A权利要求书1/1页1.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用红细胞膜囊泡与细胞外囊泡发生膜融合，将针对目标miRNA设计的特异性发夹探针递送到细胞外囊泡中完成DNA自组装反应，实现对胞外囊泡携带的miRNA的原位荧光检测。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述特异性发夹探针的数量为三条，在三条特异性发夹探针的序列中均存在自身互补序列和互补回文序列，并在其中两条特异性发夹探针中均修饰有荧光基团和淬灭基团。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述目标miRNA包括miRNA‑21。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，针对miRNA‑21设计的特异性发夹探针包括A‑Cy5、B和C‑Cy5，其中A‑Cy5的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQIDNO.1所示序列的第11位的T上修饰淬灭基团，在第53位的T上修饰荧光基团；B的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；C‑Cy5的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQIDNO.3所示序列的第6位的T上修饰荧光基团，在第54位的T上修饰淬灭基团。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述荧光基团包括Cy5，所述淬灭基团包括BHQ2。6.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA‑21的体系，其特征在于，包括：miRNA‑21标准品、针对miRNA‑21设计的特异性发夹探针包括A‑Cy5、B和C‑Cy5，其中A‑Cy5的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQIDNO.1所示序列的第11位的T上修饰BHQ2，在第53位的T上修饰Cy5；B的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；C‑Cy5的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQIDNO.3所示序列的第6位的T上修饰Cy5，在第54位的T上修饰BHQ2。7.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA‑21的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述体系、红细胞膜囊泡提取试剂和细胞外囊泡提取试剂。8.基于权利要求6所述体系或权利要求7所述试剂盒原位检测细胞外囊泡携带miRNA‑21的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用终浓度相同的A‑Cy5、B和C‑Cy5与不同浓度的miRNA‑21标准品混合，37℃孵育120min后，分别进行荧光光谱分析，绘制标准曲线；利用红细胞膜囊泡提取试剂提取红细胞膜囊泡，将得到的红细胞膜悬液与A‑Cy5、B和C‑Cy5混合后共挤出，得RVs；将RVs与利用细胞外囊泡提取试剂提取得到的细胞外囊泡混合，37℃孵育120min后，进行相同的荧光光谱分析。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述A‑Cy5、B和C‑Cy5的终浓度均为200nM。10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述RVs的粒径分布在122nm至396nm的范围内。2CN115820812A说明书1/9页一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒技术领域[0001]本发明属于检测技术领域，具体涉及一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒。背景技术[0002]微小RNA(microRNAs、miRNAs)是一种单链的、短的(大约19～23个核苷酸)、内源性的、非编码的调节性RNA，其在许多生物过程中是至关重要的。作为基因表达过程的一个重要环节，miRNAs已被确定