一种高效包裹蛋白质的细胞外囊泡及其制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115851839A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211357731.2C12N5/10(2006.01)(22)申请日2022.11.01C12R1/91(2006.01)(71)申请人陕西师范大学地址710100陕西省西安市长安区西长安街620号(72)发明人李星赵卓华张媛何瑾齐雯卉高蕊(74)专利代理机构北京卓胜佰达知识产权代理有限公司16026专利代理师刘冬梅(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N15/12(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种高效包裹蛋白质的细胞外囊泡及其制备方法(57)摘要本发明涉及生物药物载体制备技术领域，具体公开了一种细胞外囊泡高效包裹特异性蛋白质的技术及其制备方法，首先构建LV‑SAP‑GOI融合表达慢病毒载体，随后感染HEK293T细胞，得到293T‑SAP‑GOI稳转细胞系，使表达的外源蛋白质定位于细胞外囊泡内，从而实现了细胞外囊泡高效包裹特异性蛋白质的能力。本发明获得的细胞外囊泡特异性高效包裹蛋白质体系具有包裹效率高，可包裹目的蛋白质广泛，容易制备等优点。CN115851839ACN115851839A权利要求书1/1页1.一种高效包裹蛋白质的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，获得目的基因片段；S2，骨架载体pCDH‑SAP其特征在于其中含有SAPsignal序列，此信号肽序列位于目的基因的5’端，可将目的基因特异性表达的蛋白质靶向定位至细胞外囊泡中，即目的蛋白质被包装至细胞外囊泡内，从而使目的蛋白随着细胞外囊泡的分泌而转运至靶细胞；所述信号序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；S3，将目的基因(GOI)与骨架载体pCDH‑SAP进行连接，获得pCDH‑SAP‑GOI载体；S4，使用HEK293T细胞对pCDH‑SAP‑GOI载体进行慢病毒包装，获得LV‑SAP‑GOI慢病毒载体，然后感染HEK293T细胞并筛选获得293T‑SAP‑GOI细胞系；S5，分离得到细胞外囊泡EVs‑GOI，该EVs中富集特异性表达的目的蛋白质。2.根据权利要求1所述一种高效包裹蛋白质细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S1中，目的基因片段的获得：以成年动物组织的cDNA文库作为模板，以核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的F引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的R引物为引物对进行PCR，获得5’端和3’端分别为MCS区域限制性内切酶位点的目的基因片段。3.根据权利要求1所述一种高效包裹蛋白质细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S3中，目的基因与骨架载体pCDH‑SAP的连接，首先要对MCS区域进行限制性内切酶消化，随后再进行酶连。4.根据权利要求1所述一种高效包裹蛋白质细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S4中，慢病毒感染HEK293T细胞后的筛选具体过程为：LV‑SAP‑GOI慢病毒载体感染HEK293T细胞三天后进行两次嘌呤霉素的抗药性阳性细胞筛选，最终存活的细胞为经目的蛋白质修饰阳性的HEK293T细胞，命名为293T‑SAP‑GOI。5.根据权利要求1所述一种高效包裹蛋白质细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S5中，分离过程为：培养293T‑SAP‑GOI细胞，培养液配方为DMEM高糖基础培养基和10％去除外囊泡的胎牛血清以及1％双抗，3天后收集上清，使用0.22μm滤器过滤上清液，随后以300×g离心10min以除去细胞；2000×g离心20min和8000×g离心30min以除去细胞碎片；最后在4℃下以110,000×g离心70min，去除上清液后用PBS重悬再次离心，即可获得细胞外囊泡EVs‑GOI。6.根据权利要求1所述一种高效包裹蛋白质细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S5中，制备得到的细胞外囊泡EVs‑GOI来源为人胚胎肾细胞。7.一种权利要求1‑6任一项所述的制备方法制备得到的细胞外囊泡。2CN115851839A说明书1/5页一种高效包裹蛋白质的细胞外囊泡及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物药物载体制备技术领域，具体涉及一种高效包裹蛋白质的细胞外囊泡及其制备方法。背景技术[0002]HEK293T细胞是一种衍生自人胚胎肾细胞的细胞系,它具有高产量、易生长、内源性生物量少等优点，且易于处理和转染，具有较高的细胞外囊泡产生能力。[0003]EVs是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从10nm到1000nm不等，其中含有各种类型的分子货物，如蛋白质、mRNA、miRNA以及各种代谢物。据报道，EVs