一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115873832A(43)申请公布日2023.03.31(21)申请号202210987248.6C12P19/16(2006.01)(22)申请日2022.08.17C12P19/12(2006.01)C12P19/04(2006.01)(71)申请人江南大学C12P19/00(2006.01)地址214122江苏省无锡市滨湖区蠡湖大C12R1/19(2006.01)道1800号(72)发明人张显饶志明王志胡孟凯徐美娟(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211专利代理师仇钰莹(51)Int.Cl.C12N9/44(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明在高酶活长野芽胞杆菌来源普鲁兰酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株D147F，G690M以及一株组合突变体D147F/G690M。且突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明中的这些突变体比天然普鲁兰酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。CN115873832ACN115873832A权利要求书1/1页1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的普鲁兰酶的第147位和/或第690位的氨基酸进行突变。2.根据权利要求1所述的普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体为(a)、(b)或(c)：(a)将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的普鲁兰酶的第147位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸；(b)将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的普鲁兰酶的第690位的甘氨酸突变为甲硫氨酸；(c)将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的普鲁兰酶的第147位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，并将第690位的甘氨酸突变为甲硫氨酸。3.编码权利要求1或2所述的普鲁兰酶突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组载体。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，以pET‑28a(+)作为表达载体。6.携带权利要求3所述基因，或含有权利要求4或5所述重组载体的重组微生物细胞。7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pET‑28a(+)作为表达载体，表达权利要求1或2所述的普鲁兰酶突变体。8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。9.一种提高普鲁兰酶热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的普鲁兰酶的第147位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，和/或将第690位的甘氨酸突变为甲硫氨酸。10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述的重组载体，或权利要求6所述的重组微生物细胞，或权利要求7或8所述的重组大肠杆菌在水解淀粉生产低聚异麦芽糖中的应用。2CN115873832A说明书1/6页一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法技术领域[0001]本发明涉及一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。背景技术[0002]低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)是一类功能性低聚糖，由2～10个α‑1、6‑糖苷键连接的葡萄糖基组成，包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等主要功能成分。IMOs可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌在人体肠道中的增殖，调节肠道菌群；有低热量值，促进胃肠蠕动，改善便秘和脂质代谢，防龋齿等功能，因此，IMOs被广泛用作益生素、食品添加剂和饲料成分。[0003]普鲁兰酶(EC3.2.1.41)是淀粉脱支酶之一，能专一性地水解淀粉分支点上的α‑1，6糖苷键，释放直链淀粉，有利于糖化酶的淀粉糖化与葡萄糖生成，从而显著提升淀粉糖化效率与淀粉到葡萄糖的转化率，是淀粉制糖工业中重要且不可或缺的辅助用酶。从20世纪80年代起，国外学者相继发现与解析了多种不同来源的普鲁兰酶。但是至今为止，在淀粉制糖工业中，仅Ⅰ型普鲁兰酶呈现出较好的与糖化酶复配或复合的作用。其中，长野芽胞杆菌(Bacillusnaganoensis)普鲁兰酶(PulA)具有较高的催化活性，具备现实工业应用价值。[0004]目前，一般通过酶促转化的方法生产IMOs，利用α‑淀粉酶、β‑淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖苷酶从淀粉中催化生产，其典型的生产过程通常包括3个步骤：一是液化，其中淀粉被耐热α‑淀粉酶液化产生低聚糖和糊精；二是糖化，低聚糖和糊精被β‑淀粉酶和普鲁兰酶等糖化酶糖化；三是转