热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102660517A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102660517A(43)申请公布日2012.09.12(21)申请号201110406922.9(51)Int.Cl.(22)申请日2011.12.08C12N9/20(2006.01)C12N15/55(2006.01)(83)生物保藏信息C12N15/63(2006.01)CGMCCNo.53892011.10.24C12N1/21(2006.01)CGMCCNo.53882011.10.24CGMCCNo.53872011.10.24CGMCCNo.53902011.10.24(71)申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人冯雁谢渊杨广宇(74)专利代理机构上海科盛知识产权代理有限公司31225代理人杨元焱权利要求书权利要求书2页2页说明书说明书1111页页附图附图11页(54)发明名称热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法(57)摘要本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。热稳定性提高的脂肪酶突变体由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQIDNo：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQIDNo：2、SEQIDNo：3或SEQIDNo：4所示的氨基酸残基序列，SEQIDNo：2、SEQIDNo：3和SEQIDNo：4均由317个氨基酸组成。本发明运用半理性设计的方法，对南极假丝酵母脂肪酶B基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突15变D223G、L278M及它们的组合。以各自的T50及48℃的半衰期t1/2来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。CN102657ACN102660517A权利要求书1/2页1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于：由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQIDNo：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQIDNo：2、SEQIDNo：3或SEQIDNo：4所示的氨基酸残基序列，SEQIDNo：2、SEQIDNo：3和SEQIDNo：4均由317个氨基酸组成。2.根据权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因；上游引物：5’-AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’，带下划线碱其为限制性内切酶NcoI识别位点；下游引物：5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点；以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b(Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB；B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID：1TCA)，脂肪酶的催化三联体为：自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点：自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选C1、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2％(v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37℃下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库；C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体将步骤C1中37℃培养后的LB抗性平板在4℃下放置1天，进行初步筛选，