一种高产普鲁兰酶的重组需钠弧菌及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115851568A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211581907.2(22)申请日2022.12.09(71)申请人南京林业大学地址210037江苏省南京市玄武区龙蟠路159号(72)发明人段绪果张玉华(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204专利代理师王艳(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12R1/63(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种高产普鲁兰酶的重组需钠弧菌及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种高产普鲁兰酶的重组需钠弧菌，所述重组需钠弧菌由重组质粒OmpA‑PulA导入宿主需钠弧菌得到，所述重组质粒OmpA‑PulA由普鲁兰酶的编码基因和OmpA的信号肽编码基因与表达载体连接构建而成。本发明还公开了一种利用所述重组需钠弧菌高效发酵生产鲁兰酶的方法。本发明首次实现了普鲁兰酶PulA在需钠弧菌中的分泌表达，并且利用本发明的发酵方法生产普鲁兰酶PulA，胞外酶活高达83.3U·mL‑1，是大肠杆菌中酶活7.3U·mL‑1的11.4倍，活力提高显著。CN115851568ACN115851568A权利要求书1/1页1.一种重组需钠弧菌，其特征在于，所述重组需钠弧菌由重组质粒OmpA‑PulA导入宿主需钠弧菌得到，所述重组质粒OmpA‑PulA包括普鲁兰酶的编码基因和信号肽OmpA的编码基因与表达载体连接构建而成。2.根据权利要求1所述的一种重组需钠弧菌，其特征在于，所述普鲁兰酶的编码基因如SEQIDNO.1所示，所述信号肽OmpA的编码基因如SEQIDNO.2所示。3.一种权利要求1或2所述的重组需钠弧菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用化学合成法将普鲁兰酶的编码基因和信号肽OmpA的编码基因连接得到连接片段；(2)将步骤(1)的连接片段与表达载体同源重组，得到重组质粒OmpA‑PulA。(3)将步骤(2)得到的重组质粒OmpA‑PulA电击转化需钠弧菌即得。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pET24a(+)，所述普鲁兰酶的编码基因序列如SEQIDNO.1所示，所述信号肽OmpA的编码基因序列如SEQIDNO.2所示，所述连接片段的基因序列如SEQIDNO.3所示，所述连接片段对应的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。5.权利要求1或2所述的重组需钠弧菌、权利要求3或4所述的重组需钠弧菌构建方法在生产普鲁兰酶中的应用。6.一种利用权利要求1或2所述的重组需钠弧菌发酵生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在25～30℃下，挑取权利要求1或2所述的重组需钠弧菌的单菌落，转移至BHIv2液体培养基中培养6‑8h；(2)在25～30℃下，将步骤(1)得到的菌液按4～8％的接种量转接至新鲜TBv2液体培养基中，培养1～2小时；(3)在25～30℃下，向TBv2液体培养基加入异丙基硫代‑D半乳糖苷诱导培养34～38小时，得到包含普鲁兰酶的发酵液。7.根据权利要求6所述的发酵生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述BHIv2液体培养基成分为BHIBroth、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、卡那霉素。8.根据权利要求6所述的发酵生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述TBv2液体培养基成分为甘油、胰蛋白胨、酵母粉、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、卡那霉素、甘氨酸。9.根据权利要求6所述的发酵生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，步骤(3)中所述异丙基硫代‑D半乳糖苷添加浓度为0.05～2.0mmol·L‑1。10.根据权利要求8所述的发酵生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述甘氨酸的终浓度为10～40g·L‑1。2CN115851568A说明书1/7页一种高产普鲁兰酶的重组需钠弧菌及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种高产普鲁兰酶的重组需钠弧菌及其构建方法和应用。背景技术[0002]普鲁兰酶(pullulanase)是一种GH13糖苷水解酶家族的淀粉脱支酶，可以作用于α‑1,6‑葡萄糖苷键，可以高效地水解普鲁兰多糖和较低分子量的分支糊精，广泛应用于淀粉糖、抗性淀粉、环糊精等产品的生产。由于普鲁兰酶蛋白分子普遍偏大，一般含有900个以上的氨基酸，单亚基分子量约在100kDa；此外，普鲁兰酶单亚基通常含有6个结构域，并含有一些特有的氨基酸序列，这导致了普鲁兰酶极易形成包涵体，难以分泌到胞外