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本发明公开了一种扩增犬冠状病毒S基因全序列的引物、方法和应用,引物序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.2所示;方法包括以下步骤:步骤一、提取病毒RNA;步骤二、cDNA合成;步骤三、PCR扩增;步骤四、基因片段检测及测序。本发明还提供了一种犬冠状病毒S基因全序列扩增方法的应用,用于对犬冠状病毒S基因全序列的检测与分析。本公开的扩增方法,无需采用常规多对引物进行拼接的方案,通过设计1对引物即实现了犬冠状病毒S基因S基因全序列的扩增,不仅操作便捷,还可以避免在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。