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本发明适用于分子诊断技术领域,提供了一种靶向探针及其制备方法和应用,该靶向探针的制备方法包括以下步骤:将含非突出脂肪胺基团的核苷酸类似物用酶催化插入到单链或双链DNA,产生胺基修饰的DNA片段;用化学方法将具有胺反应活性的荧光标记所述胺基修饰的DNA片段,得到所述靶向探针。本发明可以通过调节aa?dUTP和dTTP比例很好地把控探针的重复性和稳定性,其便于规模化生产,而且对颜料要求不高,不同颜料标记的效果相似。另外,本发明制得的靶向探针信号大,亮点强,容易观察,重复性和稳定性较好,应用更广泛,其能够用于直接检测宫颈癌和膀胱癌等肿瘤早期标记物。