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本发明属于生物技术领域,具体为一种肿瘤细胞外囊泡DNA的分离纯化方法,包括以下步骤:S1、将囊泡裂解液与含DNA的生物样本混匀后共孵育,得到裂解溶液;所述含DNA的生物样本为肿瘤细胞外囊泡;S2、向所述裂解溶液中加入沉淀液混匀,离心得到上清液;S3、向所述上清液中加入析出液,析出DNA并离心获得沉淀物;S4、用洗涤液对沉淀物进行洗涤,得到纯化的DNA。整个操作步骤简便,所需时间不超过40min,大大简化了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取流程,同时提高了肿瘤细胞外囊泡DNA的提取效率和纯度。