一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106289927A(43)申请公布日2017.01.04(21)申请号201610744198.3(22)申请日2016.08.28(71)申请人浙江省中医院地址310006浙江省杭州市上城区邮电路54号(72)发明人程向东吕航徐志远(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉(51)Int.Cl.G01N1/34(2006.01)G01N1/30(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图4页(54)发明名称一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法(57)摘要本发明公开了一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；本发明采用的方法提取的总微囊泡，保留了全部微囊泡的结构和成分，产量高。并且可以进行二次分选，对特定的微囊泡进行分析，提高了提取效率和研究价值。总共的提取时间最少只要4小时，就可以完成微囊泡的提纯，最少5小时可以完成外泌体的提纯。而且提取的纯度更高，实验表明，提取的微囊泡占总提取蛋白的90％以上，而有机沉淀的比例不足20％。CN106289927ACN106289927A权利要求书1/2页1.一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100-300rpm水平振荡条件下孵育3-16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；所述偶联复合物是由偶联物与载体偶联制备而成，所述偶联物为亲脂性羰花青染料，所述载体为四氧化三铁磁微球、乳胶微球、聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒或胶体金颗粒。2.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞为人胃腺癌细胞AGS、人胃腺癌细胞BGC-823、人胃癌细胞、HGC-27、人胃癌细胞MGC80-3或人胃癌细胞MKN-45。3.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述培养液重复离心，取最后一次离心上清液与偶联复合物混合；所述最后一次离心的上清液体积用量以偶联复合物质量计为1000～2000ml/g。4.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联物为亲脂性羰花青染料DiI、亲脂性羰花青染料DiO、亲脂性羰花青染料DiD或亲脂性羰花青染料CM-DiI。5.如权利要求4所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成。6.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液200×g离心10分钟，获得上清液a，然后将上清液a再2000×g离心15-40分钟，取上清液b与偶联复合物混合。7.如权利要求6所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述上清液b用100KDa超滤管在5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液与偶联复合物混合。8.如权利要求1所述从肿瘤细胞上清中分离微囊泡的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液a；(2)将上清液a加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液b；(3)将上清液b加入100KDa超滤管中，5000rpm离心15分钟，弃滤液，取截留液于第三离心管中，加入偶联复合物，置于4℃、100-300rpm水平振荡下孵育3-16小时，移除液体，获得孵育后的偶联复合物；所述偶联复合物由亲脂性羰花青染料DiO与四氧化三铁磁微球偶联制成；(4)向步骤(3)孵育后的偶联复合物加入1×PBS充分重悬，再移除液体，然后用1×PBS充分清洗偶联复合物，去除洗液，获得吸附微囊泡的偶联微球。9.一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡外泌体的方法，其特征在于所述方法为：(1)将肿瘤细胞接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞培养液，加入第一离心管中，200×g离心10分钟，分离得到上清液A；(2)将上清液A加入第二离心管中，在2000×g离心15-40分钟，获得上清液B；(3)将上清液B加入第三离心管中，在10000×g离心40-70分钟，获得上清液C；(4)将上