胞外囊泡纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113388520A(43)申请公布日2021.09.14(21)申请号202110676767.6(22)申请日2021.06.17(71)申请人中国科学院城市环境研究所地址361021福建省厦门市集美区集美大道1799号(72)发明人黄乾生黄海宁郭子晗竹李婷(74)专利代理机构北京风雅颂专利代理有限公司11403代理人李弘(51)Int.Cl.C12N1/02(2006.01)C12N5/04(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图6页(54)发明名称胞外囊泡纯化方法(57)摘要本公开提供一种大体积样液的胞外囊泡纯化方法。所述方法包括提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。所得胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，可满足后续NTA、电镜和蛋白组等分析。且操作简便，耗时短。CN113388520ACN113388520A权利要求书1/2页1.一种胞外囊泡纯化方法，其特征在于，包括：提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分具体包括：分别检测每份流下组分的平均粒径或者游离蛋白浓度；筛选平均粒径符合目标粒径或游离蛋白浓度符合目标浓度的流下组分。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每份流下组分的体积为1～1.25ml；所述目标粒径为30～200nm；所述游离蛋白目标浓度为小于2.0ug/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样液选自细菌培养液、藻细胞培养液和植物裂解液中的至少一种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取胞外囊泡具体包括：将样液进行离心，得到上清液；离心条件为，离心力9800～10200g，离心时间为10～20min；将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液；其中，第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理；将过滤液进行超速离心处理或者进行试剂盒提取，得到胞外囊泡。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一过滤处理的滤膜粒径为0.4～0.5um；所述第二过滤处理的滤膜粒径为0.20～0.22um。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液之后，将过滤液进行超速离心处理之前还包括：将过滤液用小型切向流超滤设备进行浓缩，得到浓缩液；其中，浓缩条件为截留分子量100kDa；将浓缩液进行第三过滤处理，得到滤液；其中，所述第三过滤处理的滤膜粒径与所述第二过滤处理的滤膜粒径相同；所述将过滤液进行超速离心处理包括将所述滤液进行超速离心，并用PBS缓冲液重悬沉淀；超速离心的条件为，离心力99950～100050，离心时间为1.8～2.2h。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将过滤液进行试剂盒提取之前还包括：将过滤液在超滤管中离心浓缩；所述离心浓缩的条件为截留分子量100kDa，离心力2800～3200g，离心时间为5～10min；所述将过滤液进行试剂盒提取具体包括:用细菌膜囊泡分离试剂盒提取离心浓缩所得产物。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分具体包括：用8～12ml的PBS缓冲液洗涤排阻色谱柱；将所述胞外囊泡加入洗涤后的排阻色谱柱中，等体积收集流下组分，并加入PBS缓冲液洗涤。2CN113388520A权利要求书2/2页10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将混合所得物转移至超滤管中离心的条件为：超滤管的截留分子量为100kDa；离心力2800～3200g，离心时间为5～10min。3CN113388520A说明书1/9页胞外囊泡纯化方法技术领域[0001]本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种胞外囊泡纯化方法。背景技术[0002]胞外囊泡(extracellularvesicle,EV)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称。基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类(例如外泌体、微泡等)。是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，具有重要的应用前景。[0003]现有的胞外囊泡在制备过程中，容易产生蛋白污染，无法满足后续的NTA(NanoparticleTrackingAna