多功能植物双元表达载体pRC10及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896169A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202310072919.0C12N1/21(2006.01)(22)申请日2023.02.07C12N15/11(2006.01)C12R1/19(2006.01)(71)申请人西南大学C12R1/01(2006.01)地址400715重庆市北碚区天生路2号(72)发明人张莹莹陈新龙何光华委刚徐海玲(74)专利代理机构重庆信航知识产权代理有限公司50218专利代理师穆祥维(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/74(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称多功能植物双元表达载体pRC10及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种多功能植物双元表达载体pRC10及其构建方法和应用，载体pRC10包括完整的AtUBQ10pro‑MCS1‑Linker1‑eGFP‑HSPt基因表达盒、MCS2‑Linker2‑mRFP1‑NOSt基因表达盒、CaMV35Spro‑GUS‑NPTII‑CaMVpoly(A)基因表达盒，可用于植物基因表达模式分析、基因超量表达以及蛋白质亚细胞定位，克服了传统方法中植物表达载体功能单一的不足，具有多功能、通用性强、应用广泛等优点；并且，载体pRC10含有GUS‑NPTII融合筛选标记，可对pRC10及其重组载体的转基因植株或转基因细胞系进行GUS染色及卡那霉素双重筛选，能快速、准确鉴定出阳性转化子，有效提升实验效率，节约成本。CN115896169ACN115896169A权利要求书1/2页1.一种多功能植物双元表达载体pRC10，其特征在于，所述多功能植物双元表达载体pRC10为pRI201‑AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T‑DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架，与含有T‑DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC10进行无缝连接，重组而成的环状载体；其中，所述人工合成片段RC10由AtUBQ10pro‑MCS1‑Linker1‑eGFP‑HSPt基因表达盒、MCS2‑Linker2‑mRFP1‑NOSt基因表达盒、CaMV35Spro‑GUS‑NPTII‑CaMVpoly(A)基因表达盒依次串联，并在串联序列5’端和3’端分别添加含有15bp与pRI201‑AN线性骨架特异性重组的接头序列的HindIII和AvrII酶切位点而成；其中，所述AtUBQ10pro‑MCS1‑Linker1‑eGFP‑HSPt基因表达盒由拟南芥启动子AtUBQ10pro、带有KpnI和BamHI特异性酶切位点的多克隆位点MCS1、连接肽Linker1GGGGSGGGGSGGGGS编码序列、绿色荧光标签eGFP以及热激蛋白终止子HSPt依次连接组成；所述MCS2‑Linker2‑mRFP1‑NOSt基因表达盒由包含SalI、EcoRI和SpeI特异性酶切位点的多克隆位点MCS2、连接肽Linker2GGGSGGG编码序列、红色荧光标签mRFP1及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成；所述CaMV35Spro‑GUS‑NPTII‑CaMVpoly(A)基因表达盒由包含SalI、EcoRI和SpeI特异性酶切位点的多克隆位点MCS2、连接肽Linker2GGGSGGG编码序列、红色荧光标签mRFP1及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成。2.根据权利要求1所述的多功能植物双元表达载体pRC10，其特征在于，所述人工合成片段RC10的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求2所述的多功能植物双元表达载体pRC10，其特征在于，所述多功能植物双元表达载体pRC10的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。4.权利要求1所述多功能植物双元表达载体pRC10的构建方法，其特在在于，包括如下：对pRI201‑AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T‑DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架；用重组酶将所述线性载体骨架与含有T‑DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC10进行无缝连接，重组为环状载体；转化大肠杆菌，测序确定阳性克隆，获得多功能植物双元表达载体pRC10；其中，所述人工合成片段RC10由AtUBQ10pro‑MCS1‑Linker1‑eGFP‑HSPt基因表达盒、MCS2‑Linker2‑mRFP1‑NOSt基因表达盒、CaMV35Spro‑GU