一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114807138A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210499882.5(22)申请日2022.05.09(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人杨新晏瑞岭徐思裴周国辉郑丽贤(74)专利代理机构广州智斧知识产权代理事务所(普通合伙)44649专利代理师朱双(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/82(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用。本发明的植物环状RNA过表达载体，其含有的植物环状RNA成环框架包括上游框架序列、待表达目的基因序列和下游框架序列，所述的上游框架序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游框架序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明构建的植物环状RNA过表达载体能够高效稳定的适用于各种目的基因序列的成环表达，且构建方法操作简单，成环位点准确，为深入研究环状RNA的功能提供了高效简洁的研究手段。CN114807138ACN114807138A权利要求书1/1页1.一种植物环状RNA成环框架，其特征在于，包括上游框架序列、待表达目的基因序列和下游框架序列；所述的上游框架序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游框架序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的植物环状RNA成环框架，其特征在于，在所述的上游框架序列后添加有酶切位点SalI，在所述的下游框架序列前添加有酶切位点BamHI，待表达目的基因序列插入在酶切位点SalI和BamHI之间。3.一种植物环状RNA过表达载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的植物环状RNA成环框架。4.一种植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，是将权利要求1或2所述的植物环状RNA成环框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。5.根据权利要求4所述的植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pLX。6.根据权利要求5所述的植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，扩增用于同源重组的表达载体pLX骨架的引物为pLX‑R：GCAAGCTAGAAACGTGACAGTTTCCTCTCCAAATGAAATGAAC和pLX‑F：CTCCTACGATCTTTGCACTGTCGATCGTTCAAACATTTGGCAA。7.权利要求1所述的植物环状RNA成环框架或权利要求3所述的植物环状RNA过表达载体在过表达目的基因环状RNA中的应用。8.一种目的基因环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，在待表达目的基因序列两端添加酶切位点SalI和BamHI，然后酶切连接至权利要求3所述的植物环状RNA过表达载体的酶切位点SalI和BamHI之间。2CN114807138A说明书1/5页一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用。背景技术[0002]环状RNA(circularRNAs,circRNAs)是一类由特殊前体mRNA选择性剪接产生的封闭环状(3'‑5'共价闭合)非编码RNA，普遍存在于真核细胞中。研究表明，植物环状RNA具有高稳定性和保守性以及低表达和时空表达特异性。根据来源，植物环状RNA主要分为内含子、外显子、内含子‑外显子、基因间区、反义链五种类型，其中外显子来源的环状RNA比例相对较大。通过生物信息学预测并结合分子生物学验证是当前研究植物环状RNA的主要方法。通常植物环状RNA作为microRNA的海绵，调节宿主基因选择性剪接和表达；此外，植物环状RNA广泛参与生长发育以及生物/非生物胁迫应答等生物学过程。因此，构建高效准确的植物环状RNA过表达载体，对深入研究植物环状RNA的功能十分关键。[0003]目前对于植物环状RNA的研究尚不深入，植物环状RNA的生物学功能和调控机制仍不清楚。正如常规基因功能和机制研究一样，研究植物环状RNA的生物学功能和分子机制的一个重要手段就是在植物细胞内过表达环状RNA，观察其对细胞功能的影响并阐述其参与调控细胞功能的分子机制。因此，想要在植物细胞内引入过表达的环状RNA，就必须有稳定可靠的环状RNA过表达工具。目前植物环状RNA的过表达载体较少，主要是以基因组DNA为模板，扩增一段内含子序列(上游环化序列)及其反向互补序列(下游环化序列)，并通过同源重组技术构建成环框架，随后将目的环状RNA序