重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115894695A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211411123.5G01N33/577(2006.01)(22)申请日2022.11.11G01N33/574(2006.01)C12R1/91(2006.01)(71)申请人郑州伊美诺生物技术有限公司地址450016河南省郑州市经济技术开发区第六大街133号1号厂房(72)发明人韩阳瑞赵巧辉李桂林田晓平王格付光宇吴学炜杨增利(74)专利代理机构郑州异开专利事务所(普通合伙)41114专利代理师杜雪丽(51)Int.Cl.C07K16/30(2006.01)C12N5/20(2006.01)C12N15/13(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用，其中重组SCCA单克隆抗体包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。本发明制备的重组SCCA单克隆抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，可重复表达。将制备的重组SCCA单克隆抗体应用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中，临床检测灵敏度高，检测时通过对雅培样本的检测，结果发现本发明重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本发明制备的重组SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。CN115894695ACN115894695A权利要求书1/1页1.一种重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。2.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQIDNO.5所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQIDNO.6所示的氨基酸序列。4.权利要求2或3所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，用免疫原制备杂交瘤细胞株并从其中提取RNA，反转录获得cDNA；第二步，设计引物，以cDNA为模板，扩增含有SEQIDNO.1/SEQIDNO.5的轻链可变区和含有SEQIDNO.2/SEQIDNO.6的重链可变区的编码基因；第三步，将带信号肽与轻链恒定区的表达载体和信号肽与重链恒定区的表达载体，分别进行双酶切；分别与目的轻链基因和目的重链基因采用同源重组的构建方法进程重组构建，构建成功的质粒转入感受态细胞，挑选阳性克隆测序；将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒；第四步，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO‑S细胞，4‑5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到重组SCCA单克隆抗体。5.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：扩增含有SEQIDNO.1的轻链可变区和含有SEQIDNO.2的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因。6.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：扩增含有SEQIDNO.5的轻链可变区和含有SEQIDNO.6的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因。7.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的制备方法为：第一步，采用重组抗原或浓缩后的人源汗液作为免疫原，首先将免疫原稀释成一定浓度后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行乳化，对小鼠进行基础免疫、加强免疫和融合前冲击免疫；第二步，采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；第三步，选取血清效价最高的鼠脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经过多次亚克隆即可获得稳定分泌抗SCCA的杂交瘤细胞株