一种重组蛋白质及其单克隆抗体的制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102659937A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102659937A(43)申请公布日2012.09.12(21)申请号201210070682.4C12R1/19(2006.01)(22)申请日2012.03.16(71)申请人杭州贤至生物科技有限公司地址311100浙江省杭州市余杭区余杭经济开发区振兴东路9号(72)发明人吴琼杉汪俊余铭恩李会强冯俊涛李晓照(74)专利代理机构杭州中平专利事务所有限公司33202代理人翟中平(51)Int.Cl.C07K14/47(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/63(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书77页页C07K16/18(2006.01)序列表序列表33页页(54)发明名称一种重组蛋白质及其单克隆抗体的制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种重组蛋白，该重组包含人心脏型脂肪酸结合蛋白两个优势抗原表位，并采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，ELISA正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于心肌梗死早期诊断。CN10265937ACN102659937A权利要求书1/1页1.一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质具有如序列表SEQIDNo：1所示的氨基酸序列。2.一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质包含如序列表SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示的氨基酸序列。3.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQIDNo：4所示，可编码权利要求1-2所述的重组蛋白质。4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。5.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。6.根据权利要求1-2所述的重组蛋白质，其特征在于可用于心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备，包括：(a)合成权利要求3所述的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的重组蛋白表达载体转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株；(c)大规模培养重组蛋白表达菌株后，经纯化获取重组蛋白；(d)重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株；(e)纯化单抗并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，ELISA正交实验确定最佳单抗配对组合。2CN102659937A说明书1/7页一种重组蛋白质及其单克隆抗体的制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种新的重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述的重组蛋白制备心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，并应用于急性心肌梗死(AMI)早期诊断。背景技术[0002]急性心肌梗死是指急性、持续性缺血、缺氧(冠状动脉功能不全)所引起的心肌坏死，是一种严重影响人类健康的心血管疾病。近年来，该疾病的发病率逐年上升，患病人群年轻化趋势愈演愈烈，但治疗效果却不甚理想，其中的一个关键原因是无法实现急性心肌梗死的早期快速诊断以争取治疗时间。从而导致患者病情恶化甚至死亡。因此，能够在心肌梗死的早期做出正确的诊断显得尤为重要。[0003]研究表明，人心脏型脂肪酸结合蛋白(fabp3)是目前早期诊断AMI最具有特异性和敏感性的生化指标。该蛋白等电点为5.1，分子量为15KD左右，它可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，是脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。正常人的血液中不含有心脏型脂肪酸结合蛋白，但在胸痛后0.5-3小时后浓度开始上升，在4-8小时内达到最高值，在12-24小时内恢复到正常水平；而且心脏型脂肪酸结合蛋白专一于心肌的损伤，具有高度特异性，基于心脏型脂肪酸结合蛋白的以上特点使得其成为理想的AMI早期诊断指标。因此，特异性检测识别人心脏型脂肪酸结合蛋白显得尤为重要。目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已成为主流方向。该方法主要是通过制备得到的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体实现对人心脏型脂肪酸结合蛋白的特异性检测。常规的人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，但由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难，表达量极低，导致后续的纯