用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107338262A(43)申请公布日2017.11.10(21)申请号201710417471.6C12N1/21(2006.01)(22)申请日2017.06.06C12R1/46(2006.01)(71)申请人中国水产科学研究院珠江水产研究所地址510000广东省广州市荔湾区芳村西朗兴渔路1号(72)发明人张德锋可小丽卢迈新刘志刚曹建萌王淼衣萌萌刘春(74)专利代理机构佛山帮专知识产权代理事务所(普通合伙)44387代理人颜春艳(51)Int.Cl.C12N15/74(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表4页附图1页(54)发明名称用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用(57)摘要本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用；本发明将鱼源无乳链球菌recA基因的启动子通过overlapPCR的方法融合至mcherry基因的上游，然后将此融合片段连接至pBCH载体上，即为pBCH-RM质粒。通过将pBCH-RM质粒应用到鱼源无乳链球菌菌株上，使其能够高效且稳定表达红色荧光蛋白，而且其保留了亲本菌株的强毒性生物学特征，能够应用于无乳链球菌的传播途径、荧光示踪和病原与宿主相互作用等基础研究。CN107338262ACN107338262A权利要求书1/2页1.用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒，其特征在于，所述载体为pBCH-RM质粒，所述pBCH-RM质粒的序列号为SEQIDNo.1。2.权利要求1所述用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，具体步骤为：(1)启动子PrecA的制备：以鱼源无乳链球菌基因组为模板，引物为PrecA-F和PrecA-R，PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得启动子PrecA片段；其中，PrecA-F：CAGGCTAGCGGTATCGGTTTAACGGGAGTTGCTGPrecA-R：TCGCTCACCTAAGCGCATCACTG；(2)制备红色荧光蛋白基因mcherry片段：以pmCherry-C1质粒为模板，引物：Pmche-F和Pmche-R；PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得红色荧光蛋白基因mcherry片段；其中，Pmche-F：AGTGATGCGCTTAGGTGAGCGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATPmche-R：GAAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATG；(3)启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry连接将步骤(1)中回收的启动子PrecA与步骤(2)中回收的红色荧光蛋白基因mcherry片段按照1：1进行混合作为模板；通过引物PrecA-F和Pmche-R进行overlapPCR，得到PCR产物PrecA-mcherry；(4)PCR产物的连接、纯化、转化与鉴定A.将步骤(3)纯化的PCR产物PrecA-mcherry与pBCH载体进行连接过夜，得到连接产物，通过胶回收试剂盒对连接产物进行回收，并使用双蒸水洗脱连接产物；B.回收的连接产物加入无乳链球菌感受态细胞中，混匀后加入预冷的电击杯中，静置后进行电转，加入无菌的脑心浸液培养，得到悬浮菌体；C.将所得悬浮菌体，转入至无菌的EP管中，摇床培养，收集菌体，涂布于含有四环素抗性的BHI平板，静置培养观察菌落，有红色荧光的菌落即为阳性，经过PCR验证并进行测序，鉴定得到所述用于表达荧光蛋白的无乳链球菌的质粒pBCH-RM。3.如权利要求2所述的用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述(4)PCR产物的连接、纯化、转化与鉴定中：将步骤(3)中纯化的PCR产物PrecA-mcherry与pBCH载体分别进行NheI和BglII双酶切，分别回收酶切产物；回收后的酶切产物通过T4DNA连接酶进行连接，然后使用胶回收试剂盒纯化连接产物，转化无乳链球菌感受态细胞，涂布四环素抗性平板，28℃培养2天，筛选有红色荧光的菌落。根据PCR扩增及其产物测序、菌落荧光对阳性菌落进行鉴定，鉴定得到所述用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒pBCH-RM。4.如权利要求3所述的用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述启动子PrecA制备的反应体系为：5×buffer10μL，dNTPs4μL，引物PrecA-F1μL，引物2CN107338262A权利要求书2/2页PrecA-R1μL，DNA模板1μL，ExTaq酶1μL，补H2O至50μL。5.如权利要求4所述的用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法，其特征在于，所述启动子PrecA与红