GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109136265A(43)申请公布日2019.01.04(21)申请号201811112277.8A61P15/14(2006.01)(22)申请日2018.09.25A61P31/04(2006.01)(71)申请人吉林大学地址130011吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人杨勇军颜世卿马超颖潘志明马轲陈巍(74)专利代理机构吉林长春新纪元专利代理有限责任公司22100代理人陈宏伟(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/66(2006.01)A61K48/00(2006.01)A61K38/17(2006.01)权利要求书1页说明书12页序列表1页附图7页(54)发明名称GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用(57)摘要本发明公开一种GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用，通过构建GSDMD-N基因的表达重组质粒，使其在乳腺组织及乳腺细胞内特异性表达，从而达到对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程领域。GSDMD-N蛋白是近年发现的可以特异性的识别细菌的生物膜成分心磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使细菌崩解死亡的多肽类化合物。本技术通过乳腺生物反应器，利用乳腺组织的特异性启动子WAP使外源基因GSDMD-N在动物乳腺中高效表达，并以此杀灭造成奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌，从而达到预防和治疗由金黄色葡萄球菌感染造成的奶牛乳腺炎的目的。本发明提供的重组质粒及重组减毒沙门菌具有高效、安全、成本低等优点，为防治金黄色葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎提供新途径，具有良好的应用前景。CN109136265ACN109136265A权利要求书1/1页1.一种GSDMD-N基因重组质粒，其核苷酸序列如SEQno.1所示。2.如权利要求1所述的一种GSDMD-N基因重组质粒的制备方法，包括以下步骤：（1）GSDMD-N及相关基因的引物合成；引物如下：GSDMD-N-FGAATTCATGCCATCGGCCTTTGAGGSDMD-N-RGGATCCATCTGACAGGAGACTGAGCWAP-FCTCGAGGGCCACAGTGAAGACCTWAP-RGAATTCGGTGTCGGCGGCGGEGFP+His-FGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGEGFP+His-RGGCCGCTTAATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCAT（2）GSDMD-N及相关基因片段的Pcr扩增；（3）将各片段连接到克隆载体上构成含有pEGFP-GSDMD-N-WAP-His的重组质粒，Pcr及双酶切电泳图证明重组质粒构建成功。3.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在乳腺细胞表达的方法，包括以下步骤：（1）通过电转将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207中；（2）利用携带重组质粒的减毒沙门菌SL7207侵染牛乳腺细胞；（3）westernblot检测证明GSDMD-N基因重组质粒在乳腺细胞表达成功。4.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在乳腺表达的方法，其特征在于：获得了携带GSDMD-N重组质粒的重组减毒沙门菌，使得重组质粒通过减毒沙门菌介导从而使得GSDMD-N在乳腺表达。5.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在治疗由金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎药物的用途。2CN109136265A说明书1/12页GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用[0001]技术领域：本发明提供了一种GSDMD-N基因重组质粒，是由鼠GSDMD-N基因构建而成的；本发明进一步提供了GSDMD-N基因重组质粒及其在乳腺表达的方法；利用减毒沙门菌使其在牛乳腺细胞及鼠乳腺组织中表达的方法，从而达到利用GSDMD-N蛋白对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程技术领域。[0002]背景技术：Gasdermin家族是一种含有DFNA5结构域的但是功能未知的蛋白家族，该家族主要有12个成员，该家族蛋白主要在肠道上皮和胃肠道上皮中表达，该家族蛋白的突变会造成毛囊生长发育异常，同时该家族的蛋白表达异常与肿瘤的发生密切相关，Gasdermin家族的成员N端有介导细胞焦亡的功能。[0003]GasdmerminD(GSDMD)蛋白是近Gasdermin家族年来发现的天然免疫防御分子，其前体不具有生物活性。当PRRs识别外源性的PAMP，或内源性的DAMP激活炎性体后，募集接头蛋白ASC和激活Caspase-1，4，5，进而剪切GSDMD产生具有生物活性的N末端GSDMD-N蛋白。GSDMD-N蛋白可以特异性的识别细菌的生物膜成分磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使