鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CN103667519B(45)授权公告日(45)授权公告日2015.02.25(21)申请号201210361526.3(22)申请日2012.09.14(73)专利权人聊城大学地址252059山东省聊城市湖南路1号(72)发明人司振书刘金华蒲娟包静楠(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)审查员李瑞丰权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页(54)发明名称鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用(57)摘要本发明公开了一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。本发明所提供的PCR引物对由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的单链DNA。可对样品中H9亚型AIV的HA基因进行特异性扩增，目的片断长度为425bp。该方法对H3、H4、H5等其它亚型AIV以及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等无交叉反应；对病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25EID50/100μL；与病毒的血凝抑制试验等常规方法相比，鉴定结果符合率为100％。为H9亚型AIV的鉴定提供了一种快速、特异、敏感的检测手段，可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。CN103667519BCN103667519B权利要求书1/1页1.一种鉴定H9亚型禽流感病毒的RT-PCR检测方法，所述方法为：(1)样品的采集与处理、(2)总RNA的提取、(3)反转录合成cDNA、(4)PCR扩增；其中：所述总RNA的提取步骤为：1)取感染H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的鸡胚尿囊液300μL于无RNA酶的1.5mL离心管中，加入900μLTrizol试剂，Invitrogen，两者比例为1∶3，轻轻颠倒混匀10次，使核蛋白复合体完全溶解；2)加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀10次，冰浴放置5分钟，期间轻轻颠倒混匀；4℃12000rpm离心15min；3)将水相，700μL，移至一个新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀数次，-20℃放置10分钟后，4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；4)用1mL75％无RNA酶的冰乙醇洗涤，瞬时离心，弃上清，用黄枪头吸干，瞬时离心，再用白枪头吸干，置冰上干燥沉淀5～10min，使乙醇挥发；5)将干燥的RNA用11μLDEPC水溶解，即用或-80℃保存备用；所述反转录合成cDNA步骤为：1)将Oligo引物，20pmol/μL，1μL加到含RNA的11μLDEPC水中，瞬时离心，65℃水浴5min后，置于冰上5min，使RNA线性化；2)反转录体系共20μL：由Oligo引物1μL；总RNA11μL；5×Reaction，4μL；10mMdNTPMix2μL；RibolockTMRnaseInhibitor，20U/μL，1μL；RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase，200U/μL，1μL组成；3)所述的RNA线性化步骤1)完成后，依次加入反转录体系中的其余4种成分，混匀，瞬时离心；反应条件：37℃水浴1h，65℃5min，4℃保存；所述PCR扩增步骤为：1)采用总体积为25μL的反应体系：2×PCRMIXbuffer12.5μL；其中，PCRMIXbuffer的成分为EasyTaqRNA聚合酶、dNTPS及反应缓冲液；浓度为20pmol/μL，序列表SEQIDNO：1引物1μL；浓度为20pmol/μL，序列表SEQIDNO：2引物1μL；ddH2O补足至25μL；2)双重RT-PCR循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸35s，从第二步开始进行34个循环，然后72℃延伸10min；3)取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳；H9N2亚型禽流感病毒扩增出425bp的目的条带，与预期产物大小相符。2CN103667519B说明书1/5页鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。背景技术[0002]H9亚型禽流感病毒是一种低致病性的流感病毒，1994年H9N2亚型AIV在我国广东被首次分离，十几年来，H9亚型禽流感在我国呈上升趋势，特别是在并发或继发细菌感染时，可造成严重的经济损失。目前H9亚型AIV在我国广泛存在，是影响我国养禽业的主要AIV亚型。严重影响我国养禽业的发展。H9亚型A