一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106589080A(43)申请公布日2017.04.26(21)申请号201710031421.4A61K39/10(2006.01)(22)申请日2017.01.17A61P31/04(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20166072016.11.01(71)申请人青岛易邦生物工程有限公司地址266009山东省青岛市红岛经济开发区岙东南路21号(72)发明人张恒张会范根成杜元钊(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.C07K14/235(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗(57)摘要本发明提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原的氨基酸序列为SEQIDNO:1。本发明通过对兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株主要保护性抗原蛋白基因PPP的PCR扩增，利用PET32a(+)表达性载体构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP的基因工程重组大肠杆菌BL21宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了46.2kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗。将该亚单位苗按照1.0ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株按照100LD50进行攻毒，保护率为10/10。CN106589080ACN106589080A权利要求书1/1页1.一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因用于编码权利要求1所述的抗原蛋白。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。4.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求1所述的抗原蛋白。5.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原包含有权利要求1所述的抗原蛋白。6.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗为氢氧化铝胶苗。7.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗中抗原蛋白的含量不少于160μg/ml。8.权利要求4或5所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下的步骤：1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/min离心5min，吸尽上清弃掉，提取细菌总DNA作为模板；2)通过PCR方法扩增出兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原PPP基因，回收PPP基因目的片段；3)将PPP基因的目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质粒；4)将构建的表达重组质粒通过转化BL21宿主菌,构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌的基因工程重组大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白；5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的兔支气管败血波氏杆菌的保藏编号为CCTCCNO:M2016607。10.如权利要求8所述的制备方法制备对的亚单位疫苗，按照1ml/只剂量皮下注射免疫5体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD50为4.8×10CFU)按照100LD50进行攻毒，保护率为10/10。2CN106589080A说明书1/5页一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗技术领域[0001]本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗。背景技术[0002]兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发。主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液