一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106589119A(43)申请公布日2017.04.26(21)申请号201710031666.7C12N15/70(2006.01)(22)申请日2017.01.17C07K14/195(2006.01)G01N33/569(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20166072016.11.01(71)申请人青岛易邦生物工程有限公司地址266009山东省青岛市红岛经济开发区岙东南路21号(72)发明人张恒张会范根成杜元钊(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.C07K16/12(2006.01)C07K16/06(2006.01)C12N15/31(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图1页(54)发明名称一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清(57)摘要本发明提供的兔支气管败血波氏杆菌单因子血清，是通过对基因重组工程菌的诱导、超声破碎、融合蛋白纯化、定量，将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白与弗氏完全佐剂进行乳化制备出了兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗；再将此疫苗强化免疫Balb/C小鼠，免疫结束后用QDBb01株进行攻毒，选择攻毒后无发病临床症状的健康小鼠采集血清制备成单因子血清抗体。本发明通过制备兔支气管败血波氏杆菌单因子血清抗体，将待检兔支气管败血波氏杆菌悬浮培养后，采用间接免疫荧光检测技术进行该菌悬浮状态下的一抗、二抗荧光抗体染色。该检测方法能够具体检测到兔支气管败血波氏杆菌的单个菌体，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。CN106589119ACN106589119A权利要求书1/1页1.一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清，其特征在于，所述的单因子血清的制备方法如下：从兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株基因组中PCR扩增出抗原蛋白PPP的编码基因，再将该编码基因通过PET32a(+)表达载体构建出能表达兔支气管败血波氏杆菌保护性蛋白PPP的大肠杆菌BL21重组基因工程菌，通过对基因重组工程菌的诱导、超声破碎、融合蛋白纯化、定量，将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白与弗氏完全佐剂进行乳化制备出了兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗；再将此疫苗强化免疫Balb/C小鼠三次，每次间隔14d，免疫结束后用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株进行攻毒，选择攻毒后无发病临床症状的健康小鼠采集血清制备成单因子血清抗体。2.如权利要求1所述的单因子血清，其特征在于，所述的兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株的保藏编号为CCTCCNO:M2016607。3.如权利要求1所述的单因子血清，其特征在于，所述的保护性抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。4.如权利要求1所述的单因子血清，其特征在于，所述的保护性抗原蛋白PPP的核苷酸序列为SEQIDNO:2。5.权利要求1所述的单因子血清在制备检测兔支气管败血波氏杆菌的制品中的应用。6.权利要求1所述的单因子血清在检测兔支气管败血波氏杆菌中的应用。7.一种检测兔支气管败血波氏杆菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：通过将待检测的样品菌进行3％TSB培养基培养后，先收集细胞于离心管中，1500r/min离心收集细菌，并用PBS重悬洗涤收集菌，然后加入10％多聚甲醛对重悬菌体固定、1％BSA封闭，再依次加入兔支气管败血波氏杆菌单因子血清作为一抗、FITC标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗进行赋育，以上操作步骤均采用1500r/min离心10min的方法进行洗涤多聚甲醛以及未结合的BSA、一抗和二抗，最后将染色后的细菌液滴至载玻片上，并用盖玻片封片，于荧光显微镜下观察。2CN106589119A说明书1/7页一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清技术领域[0001]本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清。背景技术[0002]兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发；该菌主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气