一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106980017A(43)申请公布日2017.07.25(21)申请号201611250386.7(22)申请日2016.12.30(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20166072016.11.01(71)申请人青岛易邦生物工程有限公司地址266009山东省青岛市红岛经济开发区岙东南路21号(72)发明人张恒郭莉莉张会范根成杜元钊(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/533(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法(57)摘要本发明提供一种用于兔支气管败血波氏杆菌的悬浮荧光免疫检测方法，包括有用于检测兔支气管败血波氏杆菌的悬浮荧光免疫检测试剂盒及其间接悬浮免疫荧光检测方法。其中，试剂盒成份包括用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体、FITC标记羊抗小鼠IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液；所述的检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体，是用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株外膜蛋白抗原免疫小鼠制备的。以此试剂盒为基础构建的兔支气管败血波氏杆菌悬浮荧光免疫检测方法，可检测临床上兔支气管败血波氏杆菌感染兔病料组织中的抗原，判定是否感染兔支气管败血波氏杆菌，其特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快。CN106980017ACN106980017A权利要求书1/1页1.一种用于检测兔支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下的组分：1)一抗：用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体；2)二抗：FITC标记的山羊抗小鼠IgG；3)PBS洗液；其配比为Nacl8.0g/L；Kcl0.2g/L；Na2HPO43.58g/L；KH2PO40.24g/L。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的单因子血清抗体，其制备方法如下：将兔支气管败血波氏杆菌进行培养，并4000r/min收集菌体，再用PH7.2的Tris-Hcl溶液重悬菌体，将重悬菌体超声波破碎，破碎工作1s，间隔时间3s，全程时间12min，总共180次；再4000r/min低速离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器，取上清液于100000r/min，超速离心20min，去上清；将含外膜蛋白的沉淀用含2％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液溶解，室温下孵育1h去除内膜蛋白，再进行100000r/min超速离心30min，沉淀用缓冲液再重悬，采用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白；将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白浓度稀释至50μg/ml，再与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化制备亚单位疫苗，将此疫苗三次强化免疫Balb/C小鼠，每次间隔14d后，用兔支气管败血波氏杆菌进行攻毒，选择攻毒后无发病临床症状的健康小鼠采集血清制备成单因子血清抗体。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的兔支气管败血波氏杆菌为兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株，保藏编号为CCTCCM2016607。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含有作为阳性对照样品的兔支气管败血波氏杆菌。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含有作为阳性对照样品的兔支气管败血波氏杆菌。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的兔支气管败血波氏杆菌为P13株。7.权利要求1所述的试剂盒在检测兔支气管败血波氏杆菌中的应用。8.一种检测兔支气管败血波氏杆菌的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的试剂盒进行检测的，操作步骤包括如下：通过将待检测的样品菌进行3％TSB培养基培养后，先收集细胞于离心管中，1500r/min离心收集细菌，并用PBS重悬洗涤收集菌，然后加入10％多聚甲醛对重悬菌体固定、1％BSA封闭，再依次加入试剂盒中制备的一抗、二抗赋育，以上操作步骤均采用1500r/min离心10min的方法进行洗涤多聚甲醛以及未结合的BSA、一抗和二抗，最后将染色后的细菌液滴至载玻片上，并用盖玻片封片，于荧光显微镜下观察。2CN106980017A说明书1/5页一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法技术领域[0001]本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法。背景技术[0002]兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发；该菌主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢