烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110760605A(43)申请公布日2020.02.07(21)申请号201911055768.8(22)申请日2019.10.31(71)申请人中国人民解放军疾病预防控制中心地址100071北京市丰台区东大街20号(72)发明人田曙光韩黎陈芳艳苏雪婷胡颖嵩陈勇赵静雅(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人刘娜(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/68(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表4页附图3页(54)发明名称烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针(57)摘要本发明涉及烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针，具体地，本发明提出了用于RPA检测的引物组合物，该引物组合物包括：正向引物，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；反向引物，所述反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。利用该RPA检测的引物组合物可以在等温条件下快速、方便、高效、特异且灵敏地检测出出菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分。CN110760605ACN110760605A权利要求书1/1页1.一种用于RPA检测的引物组合物，其特征在于，包括：正向引物，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，反向引物，所述反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。2.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：探针，所述探针具有SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的基团，所述探针自5’端起第31位碱基标记有荧光基团，所述探针自5’端起第35位碱基标记有淬灭基团，所述探针自5’端起第32位碱基被THF替代；任选地，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的基团为磷酸基团；任选地，所述荧光基团为FAM；任选地，所述淬灭基团为BHQ。5.根据权利要求2～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物与所述反向引物的摩尔浓度比为1:1。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针与所述正向引物的摩尔浓度比为1:1。7.一种检测烟曲霉的方法，其特征在于，包括：1)以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求2～6任一项所述的试剂盒对所述待测样品DNA进行RPA检测；2)基于检测结果，确定待测样品中是否含有烟曲霉。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括：步骤1)之前，预先将携带烟曲霉anxC4基因的质粒作为标准品，以不同浓度的标准品作为模板，并利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求2～6任一项所述的试剂盒对所述标准品进行RPA检测，步骤2)是通过如下方式进行的：基于待测样品与所述标准品的检测结果，确定待测样品中烟曲霉的浓度；任选地，所述携带烟曲霉anxC4基因的质粒为pMD19-T-anxC4；任选地，所述pMD19-T-anxC4质粒中，anxC4基因位于pMD19-T质粒的431bp位点和432bp位点之间；任选地，所述pMD19-T-anxC4质粒具有如图2所示的物理图谱。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述待测样品DNA来源于包括选自分离的菌体，痰、肺泡灌洗液，血液和咽拭子的至少之一；任选地，所述RPA检测是在温度为37～42℃的条件下进行15～25分钟。2CN110760605A说明书1/11页烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针技术领域[0001]本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针。背景技术[0002]烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是一种常见的机会致病菌，在环境中分布广泛，其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后极易引发侵袭性曲霉病，由于其致病机理尚不清楚，缺乏有效的治疗方法，致死率高达90％。引起侵袭性曲霉病的主要真菌是烟曲霉，一般病人只有到了患病晚期或死亡后才能检测出烟曲霉感染，因此，对烟曲霉进行早期诊断和预防至关重要。在过去的几十年里，随着高强度的免疫抑制治疗、广谱抗生素的广泛使用，导致患者体内正常菌群失调以及屏障功能被破坏，从而引起真菌移位、定植以及感染等，烟曲霉感染患者的数量也不断上升。国内外学者及临床专家普遍认为，对烟曲霉进行早期诊断并加以及时治疗是预防侵袭性曲霉病相对有效的方法。因此，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本