一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896109A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211100013.7C12N5/10(2006.01)(22)申请日2022.09.08(71)申请人五邑大学地址529000广东省江门市东成村22号(72)发明人周小青金银戈陈涛郑伟李万胜资崯邹庆剑唐成程陈敏徐巨才陈静郭素琴赖良学(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202专利代理师许东辉(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/85(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法(57)摘要本发明涉及细胞工程和基因工程领域，具体公开了一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法。本发明利用碱基编辑器ABE系统对hiPS细胞系中ABO基因进行点突变，操作简单，点突变效果更加准确。通过改造碱基编辑器ABE系统的基因组编辑技术，将抗性基因PuromycinN‑acetyl‑transferase表达在载体上，通过嘌呤霉素对电转后iPS细胞进行筛选，可以大大提高碱基编辑器ABE系统在iPSC中的基因编辑效率。优化后的碱基编辑器ABE系统基因组编辑技术具有操作简单、所需时间少、点突变效率高的特点。CN115896109ACN115896109A权利要求书1/1页1.一种靶向人ABO基因的特异性sgRNA，其特征在于，所述特异性sgRNA的靶向位点位于人ABO基因的7号外显子上；所述特异性sgRNA的序列为：(a)由SEQIDNo:1所示的核苷酸序列所示；或者，(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸组成的核苷酸序列。2.一种基于碱基编辑器ABE系统的载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求1所述的靶向人ABO基因的特异性sgRNA。3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体由质粒pCMV‑ABEmax‑P2A‑EGFP酶切后，将pCMV‑ABEmax‑P2A‑EGFP的EGFP基因序列替换成Puro基因序列，构成pCMV‑ABEmax‑P2A‑Puro；再将pCMV‑ABEmax‑P2A‑Puro带入如权利要求1所述的特异性sgRNA组成。4.如权利要求2所述的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用EcoRI和AgeI酶切pCMV‑ABEmax‑P2A‑EGFP，将pCMV‑ABEmax‑P2A‑EGFP的EGFP基因序列替换成Puro基因序列，构成pCMV‑ABEmax‑P2A‑Puro；将如权利要求1所述的特异性sgRNA插入到pU6‑gRNA载体中构建获得pU6‑ABO‑gRNA，所述特异性sgRNA插入位点为载体骨架pU6的BbSI酶切位点；将pU6‑ABO‑gRNA扩增得U6promotor‑ABO‑gRNA片段，然后将U6promotor‑ABO‑gRNA片段和pCMV‑ABEmax‑P2A‑Puro重组获得基于碱基编辑器ABE系统的载体。5.包含如权利要求1所述的特异性sgRNA或如权利要求2或3所述的载体的hiPS细胞系。6.一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将权利要求2或3所述的基于碱基编辑器ABE系统的载体电转iPSC，培养，添加嘌呤霉素，筛选后得到点突变阳性iPSC克隆，然后扩大培养；S2、对点突变阳性iPSC克隆进行多能性鉴定。7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中采用BEXCUY2EDITⅡ转染系统电转iPSC。8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S1电转结束后，将iPSC加入到含10％CloneRTM的mTeSRTM1培养基中进行培养。9.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对阳性iPSC进行PCR鉴定的步骤，PCR鉴定中的引物如SEQIDNO:2～3所示。10.如权利要求2或3所述的基于碱基编辑器ABE系统的载体或如权利要求6‑9任一项所述构建方法获得的iPSC细胞系在非疾病治疗相关基因的编辑中的应用。2CN115896109A说明书1/10页一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法技术领域[0001]本发明涉及细胞工程和基因工程领域，尤其是一种基于碱基编辑器ABE系统构建ABO基因点突变的hiPS细胞系的构建方法。背景技术[0002]ABO血型系统是卡尔·兰德施泰纳于1900年发现的，它对输血的安全至关重要，需要识别弱表型或亚型。ABO基因由7个