一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115843747A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211536289.XC12N15/113(2010.01)(22)申请日2022.12.02C12N9/22(2006.01)C12Q1/6888(2018.01)(71)申请人吉林大学C12N15/11(2006.01)地址130062吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人袁宝何松冀中豪陈健任文陟丁瑜(74)专利代理机构常州市夏成专利事务所(普通合伙)32233专利代理师王敏(51)Int.Cl.A01K67/027(2006.01)C12N15/89(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N15/12(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图3页(54)发明名称一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法(57)摘要本发明提供了一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，并初步分析了Lama3基因点突变对毛发生长的影响。该构建方法包括如下步骤：(1)靶点构建：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；(2)获取受精卵，在体外通过显微注射技术将Cas9mRNA和gRNA以及合成的donoroligo一同注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代杂合小鼠；(3)将F0代杂合小鼠自交后得到F1代小鼠；(4)F1代小鼠经测序确认获得纯合子点突变小鼠，表明模型构建成功；(5)表型分析显示Lama3基因点突变小鼠出生后第80天出现区域性脱毛。该突变小鼠模型可用于人类毛发异常疾病的药物及治疗方法的研究，为探求疾病治疗方法具有重要的实际意义。CN115843747ACN115843747A权利要求书1/2页1.一种Lama3基因点突变的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型的突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T，蛋白质第217位氨基酸从R突变为C，由精氨酸变为半胱氨酸。2.根据权利要求1所述的一种Lama3基因点突变的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型为Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠。3.一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：主要步骤如下：(1)靶点选择：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点，并对第4号外显子E4进行基因替换，野生型等位基因序列信息如下：GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATTCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中野生型等位基因序列中第4号外显子E4碱基序列为：TCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；(2)设计能够特异性识别Lama3基因的gRNA，制备gRNA与Cas9mRNA的混合物，即Cas9混样体系，所述gRNA的DNA序列为：gRNA：5’‑ATTACCTCGCCATTTTCCAGAGG‑3’；(3)利用In‑Fusion克隆技术构建载体donoroligo，所述donoroligo的DNA序列为，GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG；(4)F0代小鼠构建：包括小鼠的超排、受精卵注射及移植、F0代小鼠获得，具体如下，A.选取实验对象：挑选挑选5‑6周龄，体重为18‑22g的C57BL/6J小鼠6只；B.获取受精卵：先腹腔注射孕马血清促性腺激素PSMG，48h后注射人绒毛膜促性腺激素hCG，其中孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG的注射量各为5IU/只，14h后取卵，然后体外受精获得受精卵，将5μLCas9混样体系以及donoroligo混合注射到受精卵中，诱导受精卵的染色体基因进行突变；突变型等位基因序列信息如下：GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中突变后的第4号外显子E4碱基序列为：AGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；C.受精卵移植：注射完成后，