非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒及其制备和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115932253A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210891461.7C12N15/34(2006.01)(22)申请日2022.07.27C12N15/70(2006.01)(71)申请人广西大学地址530004广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号(72)发明人黄伟坚耿鑫梅黄香梅奚媖牡邹延林(74)专利代理机构广西南宁公平知识产权代理有限公司45104专利代理师黄宗全(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)C07K14/01(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表2页附图3页(54)发明名称非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒及其制备和应用(57)摘要本发明公开了一种非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒，包括ELISA反应板，ELISA反应板由重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L抗原包被；重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L由序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列编码或者具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。据此，发明人还建立了相应重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L和试剂盒的制备方法。研究表明，本发明能够准确检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体，与商品化检测试剂盒符合率相当。本发明成本低，试剂盒具有使用快速、准确、特异性强等优点，方便用于检测大量临床样品，为临床猪群感染情况提供依据，对于预防和控制非洲猪瘟病毒感染具有重要作用，为ASFV抗体检测、流行病学调查、净化提供一种新的有效的检测手段。CN115932253ACN115932253A权利要求书1/1页1.一种非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒，包括ELISA反应板，其特征在于：所述ELISA反应板由重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L抗原包被；所述重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L由序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列编码或者具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒，其特征在于还包括封闭液、洗涤液、稀释液、酶标试剂、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液。3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗原包被采用的包被液为ELISACoatingBuffer10×包被液；所述封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST；所述洗涤液为含0.05％Tween‑20的PBST；所述稀释液为PBST；所述酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG抗体；所述阳性对照样品为ASFV阳性血清样品；所述阴性对照样品为ASFV阴性血清样品；所述显色液为TMB底物显色试剂盒；所述终止液为1MH2SO4。4.权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：将制备得的重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释到8μg/ml，每孔100μl加入到ELISA反应板中，于37℃孵育4h即得包被抗原的ELISA反应板。5.一种重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：S1.利用特异性引物通过PCR扩增ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L基因；S2.将步骤S1所得的基因融合到原核表达质粒载体中，获得重组质粒；S3.将步骤S2所构建的重组质粒转化到宿主菌并诱导表达，获取菌液；S4.筛选步骤S3中携带ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与His融合的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L；S5.利用带His标签的镍柱亲和层析柱纯化，获得提纯后的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L。6.根据权利要求5所述的重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L的制备方法，其特征在于：所述特异性引物为序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。7.根据权利要求5所述的重组表达的ASFV非结构重组蛋白pCold‑Ⅰ‑B119L的制备方法，其特征在于：所述原核表达质粒载体为pCold‑Ⅰ，所述宿主菌为大肠杆菌。8.权利要求1所述试剂盒在非洲猪瘟病毒的非诊断检测中应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用中：ELISA抗原包被浓度8μg/ml，血清稀释度为1:100；ELISA抗原37℃包被4h，二抗稀释度为1:40000；ELISA血清孵育时间为40min，二抗孵育时间为20min；ELISA封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为1h；ELI