三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109457043A(43)申请公布日2019.03.12(21)申请号201811516523.6(22)申请日2018.12.12(71)申请人昆明理工大学地址650093云南省昆明市五华区学府路253号(72)发明人刘迪秋李欣李珊张应鹏邱炳玲(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/77(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物及检测方法(57)摘要本发明公开了一种三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物及检测方法，检测引物的核苷酸序列为：上游引物Fo-QF:5’CTCAAACAGTGGTACATGCGAGG3’；下游引物Fo-QR:5’CATCTAGGTCTTCCATCCACTTGA3’；本发明设计尖孢镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于尖孢镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明的技术和方法能快速获得复杂的三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的分子检测提供技术支持。CN109457043ACN109457043A权利要求书1/1页1.一种三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：上游引物Fo-QF:5’CTCAAACAGTGGTACATGCGAGG3’下游引物Fo-QR:5’CATCTAGGTCTTCCATCCACTTGA3’。2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取三七检测样品或土壤的DNA；（2）以提取的DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃2min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃1min，62℃30s，72℃1min，于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号；（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立制备浓度在0.0035ng/μL～35ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T-CYP505溶液，对不同浓度的溶液进行实时荧光定量PCR反应，扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；（4）若出现荧光信号则判定所检测样品中存在根腐病致病菌尖孢镰刀菌，并将获得的Ct值带入尖孢镰刀菌的标准曲线中，计算得到检测样品中尖孢镰刀菌的质量。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含2×SYBRGreenMix10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fo-QF1μL、下游引物Fo-QR1μL、DNA模板1μL。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：上游引物Fo-QF和下游引物Fo-QR的浓度均为2μmol/L。2CN109457043A说明书1/7页三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物及检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-timePCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌尖孢镰刀菌的快速分子检测，同时可实现田间三七根腐病菌的早期诊断和病菌的动态变化监测，还可以用于三七种植土壤以及种子、种苗的带菌检测，属于植物病害的分子生物学检测领域。背景技术[0002]三七(Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen)别名田七、山膝、田三七、参三七、血参、滇三七等，有“南国神草”、“金不换”之美誉。三七用于治疗疾病已几百年的历史，《本草纲目》中记载三七具有止血散血定痛之功效，对刀伤、箭伤、跌打损伤、出血不止有特效，同时三七还具有消肿止痛、抗炎、抗衰老、提高免疫力等多种功效(张静静,刘桂芹,王庆鹏.植物三七中皂苷类化学成分的研究进展.聊城大学学报(自然科学版),2018,31(2):43-59.)。三七含有多种化学成分，其中三七总皂苷为主要有效活性成分之一，其含量约为8%～12%。此外，三七中还含有醇类、黄酮类、核苷类、生物碱、蛋白质、维生素C等化合物及钾、镁、钙等多种无机元素，为三七具有多种功效的特质基础。[0003]三七具有抗血小板聚集及溶栓作用，三七总皂苷主要通过改善血管内皮的功能，改善血流状态，改善血液成分来达到抑制血小板黏附和聚集抗血栓形成的目的(WangJ,HuangZG,etal.Scre