松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110592231A(43)申请公布日2019.12.20(21)申请号201910828765.7(22)申请日2019.09.03(71)申请人中国林业科学研究院林业新技术研究所地址100091北京市海淀区香山路东小府2号(72)发明人理永霞孟繁丽刘振凯王璇冯宇倩张伟张星耀(74)专利代理机构北京思元知识产权代理事务所(普通合伙)11598代理人余光军曾晖(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图3页(54)发明名称松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒(57)摘要本发明公开了松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒。本发明以松材线虫的Bx-tlp-1基因为靶标设计了多对引物，经过筛选发现SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对扩增松材线虫和拟松材线虫DNA，结果松材线虫有特异性片段，该片段大小为755bp，而拟松材线虫无特异性片段；本发明进一步利用该特异性引物对扩增野外采集的媒介天牛组织DNA，结果扩增出松材线虫的特异性片段。本发明所筛选出的PCR特异性引物对具有良好的特异性和灵敏度，能够准确的检测媒介天牛是否携带松材线虫，并在野外对媒介天牛实现快速检测。CN110592231ACN110592231A权利要求书1/1页1.一对用于检测松材线虫的PCR特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.一种松材线虫的PCR检测方法，其特征在于，包括：(1)提取待检测样品的DNA；(2)用核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果扩增的产物有大小为755bp的扩增片段，则样品中含有松材线虫；反之，如果扩增的产物没有大小为755bp的扩增片段，则样品中不含有松材线虫。3.按照权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，35cycles；72℃终延伸10min。4.一种松材线虫的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：PrimeSTARHSDNA、PCR扩增引物对以及ddH2O；其中，所述的PCR扩增引物对为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的正向和反向引物。2CN110592231A说明书1/6页松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及松材线虫的检测方法，尤其涉及检测松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒，属于松材线虫的分子检测领域。背景技术[0002]松材线虫病(Pinewiltdisease)是由松材线虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]引起(Nickleetal.,1981)，可危害包括松属(Pinusspp.)、落叶松属(Larixspp.)、云杉属(Piceaspp.)、黄杉属(Pseudotsugaspp.)、冷杉属(Abiesspp.)和雪松属(Cedrusspp.)在内的37种松属植物和8种非松属植物，其中以松属植物为最主要的寄主(张志诚,牛海山,黄保续等.基于GIS的中国松树萎蔫病发生的适应性评价[J].兰州大学学报(自然科学版),2005,41(5):27-32)。[0003]研究发现，松材线虫致病过程中可能会分泌一些致病因子干扰或模拟松树次生代谢，诱导松树体内超量积累萜烯等次生代谢产物，最后导致松树自杀式死亡。在这一过程中，线虫分泌的某些能干扰植物防御反应的功能因子也可能是致病相关因子之一。Shinya(Shinya.,etal.,SecretomeanalysisofthepinewoodnematodeBursaphelenchusxylophilusrevealsthetangledrootsofparasitismanditspotentialformolecularmimicry.PlosOne,2013.8(6):p.e67377-e67377.)报道了在松材线虫分泌蛋白中鉴定出3条分子模拟蛋白，包括2条类甜蛋白(thaumatin-likeproteins,TLPs)、1条类半胱氨酸蛋白酶抑制剂。同时，与线虫类甜蛋白相比，松材线虫类甜蛋白与松树(松属)类甜蛋白同源性更高。前期研究已克隆了松材线虫类甜蛋白(TLP-1)基因，与松材线虫全基因组中的类甜蛋白基因相似度为98.9％，序列NCBI比对结果显示该基因与西部白