一种莱茵衣藻叶绿体-酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948450A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202210916563.XC12N15/65(2006.01)(22)申请日2022.08.01C12N15/64(2006.01)C12R1/19(2006.01)(83)生物保藏信息C12R1/865(2006.01)CCTCCNO：M202210362022.07.05C12R1/89(2006.01)(71)申请人深圳大学地址518060广东省深圳市南山区南海大道3688号(72)发明人胡章立张桂英贾彬王潮岗(74)专利代理机构深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙)44268专利代理师朱阳波(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书10页C12N15/81(2006.01)序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种莱茵衣藻叶绿体-酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体及其构建方法与应用(57)摘要本发明提供了一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体及其构建方法与应用。所述构建方法包括穿梭载体的设计、化学合成、组装鉴定以及所述穿梭载体在大肠杆菌中的复制，构建的穿梭载体能够在大肠杆菌、酵母和莱茵衣藻叶绿体之间穿梭并复制。本发明所述穿梭载体中包含酵母的复制元件(CEN)、大肠杆菌的复制元件(ori)、莱茵衣藻叶绿体基因组(SynCpV1.0)。本发明将全化学合成的穿梭载体转化莱茵衣藻细胞，实现穿梭载体的生物学功能，提取叶绿体基因组，转入大肠杆菌并实现穿梭载体在大肠杆菌中的成功复制，首次构建了能够在大肠杆菌、酵母和莱茵衣藻叶绿体之间穿梭并复制的穿梭载体。CN115948450ACN115948450A权利要求书1/1页1.一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体pSSCP的保藏号为：CCTCCM20221036。2.一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括穿梭载体的设计、化学合成、组装鉴定以及所述穿梭载体在大肠杆菌中的复制；其中，所述穿梭载体包含酵母的复制元件CEN、大肠杆菌的复制元件ori以及莱茵衣藻叶绿体基因组序列，所述穿梭载体能够在大肠杆菌、酵母和莱茵衣藻叶绿体之间穿梭并复制。3.根据权利要求2所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于，所述穿梭载体还包含酵母筛选标记、大肠杆菌筛选标记和莱茵衣藻叶绿体筛选标记。4.根据权利要求3所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于，所述的酵母筛选标记包括ura‑、met‑、let‑、His‑、Ade‑或者Lys‑。5.根据权利要求3所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于，所述的大肠杆菌筛选标记包括氨苄抗性基因、卡那霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因或者四环素抗性基因。6.根据权利要求3所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于，所述的莱茵衣藻叶绿体筛选标记包括巴龙霉素抗性基因aphVIII、链霉素抗性基因aadA、潮霉素抗性基因aphVII或博来霉素抗性基因ble中的两种或者两种以上的组合。7.一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的应用，其特征在于，将莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体应用于莱茵衣藻叶绿体工程改造，其中，所述穿梭载体按照权利要求1‑6任一所述的构建方法构建而成。8.根据权利要求7所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的应用，其特征在于，将所述穿梭载体应用于莱茵衣藻叶绿体工程改造的应用方法包括步骤：8.1将所述莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体转化酵母；8.2在酵母中对所述穿梭载体进行基因编辑；8.3提取酵母中经过基因编辑的穿梭载体，转化大肠杆菌，进行载体扩繁；8.4提取大肠杆菌中经过扩繁的载体，转化莱茵衣藻叶绿体，获得莱茵衣藻工程株；8.5提取莱茵衣藻工程株的总DNA，转化大肠杆菌，获得经过改造的新穿梭载体。9.根据权利要求8所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的应用，其特征在于，所述经过改造的新穿梭载体可再次转化酵母后进行下一轮的莱茵衣藻叶绿体基因工程改造。10.根据权利要求7所述的莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体的应用，其特征在于，将所述穿梭载体应用于叶绿体基因组编辑、叶绿体代谢通路设计改造以及叶绿体蛋白质工程。2CN115948450A说明书1/10页一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大肠杆菌穿梭载体及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及合成化学以及分子生物学领域，尤其涉及一种莱茵衣藻叶绿体‑酿酒酵母‑大