一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116003540A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211574751.5A61K39/04(2006.01)(22)申请日2022.12.08A61P31/06(2006.01)G01N33/569(2006.01)(71)申请人中国疾病预防控制中心传染病预防C12R1/19(2006.01)控制所地址102206北京市昌平区昌百路155号(72)发明人万康林刘海灿范雪亭李马超蒋毅曹滨(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002专利代理师朱惠惠(51)Int.Cl.C07K14/35(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K19/00(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用(57)摘要本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用。本发明所提供的结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010，包含抗原PPE18，FadD28、PlcA以及HspX，并通过基因工程技术将它们融合成为一种新型融合蛋白PFHP010f。本发明构建的多组分蛋白亚单位疫苗可诱导机体产生较强的细胞、体液免疫，且在小鼠免疫过程中未见明显毒副作用。本发明选择将多个结核杆菌不同感染阶段潜在抗原组分联合制备疫苗，更具有针对性，可达到甚至超过BCG的免疫保护效果，且具有成本低、安全性好等优势，有望成为结核病预防和治疗的候选疫苗。CN116003540ACN116003540A权利要求书1/1页1.一种结核分枝杆菌抗原组合物，其特征在于，包括nPPE18，nFadD28、HspX和PlcA四种抗原组分。2.一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，包含nRv1196、nRv2941、Rv2031c、Rv2351c四种基因片段的表达产物。3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，所述nRv1196的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述nRv2941的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述Rv2031c的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述Rv2351c的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，由独立表达的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA构成混合抗原PFHP010m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA。5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，nPPE18的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，nFadD28的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，HspX的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；PlcA的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。6.权利要求2‑5任一项所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m的制备方法，其特征在于，针对编码HspX和PlcA抗原的基因Rv2031c和Rv2351c，以结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组为模板，通过特异性引物利用PCR技术分别扩增各组分基因片段连接至pET32a载体上，构建重组质粒；利用基因合成技术合成编码nPPE18和nFadD28抗原的基因nRv1196、nRv2941，并连接至PMD19T质粒上后经双酶切连接至pET32a载体上，构建重组质粒；将重组质粒分别经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达，采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化目的蛋白。7.一种融合蛋白抗原PFHP010f，其特征在于，所述融合蛋白抗原PFHP010f的核苷酸序列从N端到C端按照nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c，通过linker连接得到联合基因。8.根据权利要求7所述的融合蛋白抗原PFHP010f，其特征在于，所述联合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。9.权利要求7‑8任一项所述的融合蛋白抗原PFHP010f的制备方法，其特征在于，先通过linker将选定的nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c连接构建成融合基因的重组质粒连接至pET43.1a载体，经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达融合蛋白PFHP010f；采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化表达出的蛋白。10.权利要求1所述的结核分枝杆菌抗原组合物或权利要求2‑5任一项所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m或权利要求7‑8任一项所述的融合蛋白抗原PFHP0