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本发明涉及基因检测技术领域,特别涉及一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用。包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA;所述crRNA序列包括如SEQIDNO:2或SEQIDNO:4中的任一种所示。本发明利用crRNA的特异性有效保证对细菌特征序列核酸检测的正确度,且37℃下1小时内即可通过荧光或试纸确定样品中是否存在MTB。本发明可方便快速地对MTB进行检测,且不需要复PCR仪器等复杂设备,只需要一个恒温装置及简易荧光检测装置即可快速获得可观测的结果,为MTB的检测提供更低成本,更加快速方便的检测方法,对于MTB感染的早期监测与防控有重要的意义。