烟酰胺单核苷酸的制备工艺.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004744A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211657670.1(22)申请日2022.12.22(71)申请人福州三合元生物科技有限公司地址350012福建省福州市晋安区新店镇秀山路245号索高广场2#楼4层4-2-1单元-2(72)发明人林金新黄平(74)专利代理机构深圳叁众知识产权代理事务所(普通合伙)44434专利代理师杜立光(51)Int.Cl.C12P19/30(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）(54)发明名称烟酰胺单核苷酸的制备工艺(57)摘要本发明涉及烟酰胺单核苷酸酶法生产技术领域，尤其涉及烟酰胺单核苷酸制备工艺。通过分别构建具有NZ‑CP009607.1基因与NZ_CP013124.1基因的第一重组质粒和第二重组质粒，并将第一重组质粒和第二重组质粒共同转化至大肠杆菌感受态细胞中表达，在大肠杆菌中的表达产物不仅能够作为催化剂，低成本高效制得烟酰胺单核苷酸产品，且其表达产物具有能够促进衰老小鼠细胞提高NAD+转化水平的转运蛋白，弥补了老年生物体烟酰胺单核苷酸转运能力较弱的缺陷，使制得的烟酰胺单核苷酸产品对于老年生物体依然能够具有很高的NAD+转化水平。CN116004744ACN116004744A权利要求书1/1页1.烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：构建第一重组质粒，所述第一重组质粒包含NZ‑CP009607.1基因序列；构建第二重组质粒，所述第二重组质粒包含NZ_CP013124.1基因序列；制备大肠杆菌感受态细胞，将第一重组质粒和第二重组质粒共同转化至大肠杆菌感受态细胞，转化后的大肠杆菌与培养基培养，得到NZ‑CP009607.1基因以及NZ_CP013124.1基因的表达产物；将表达产物与三乙醇胺缓冲液、烟酰胺核糖、ATP、MgCl2、表达产物反应，得到烟酰胺单核苷酸产品。2.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述第一重组质粒的载体选自pET‑28a(+)。3.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述第二重组质粒的载体选自pET‑28a(+)。4.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述大肠杆菌选自DH5α。5.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述构建第一重组质粒包括对载体通过限制性内切酶进行双酶切，所述构建第二重组质粒包括对载体通过限制性内切酶进行双酶切，所述限制性内切酶选自BamHI和EcoRI。6.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述构件第一重组质粒包括PCR扩增，所述PCR扩增的引物为：上游引物：5’‑CATGGATTCTCTTTACGAGTGGTTGATTAGACCA‑3’下游引物：3’‑CCGAATTCATCGGCGGTTATCCATAAATACCA‑5’。7.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸制备工艺，其特征在于，所述构件第二重组质粒包括PCR扩增，所述PCR扩增的引物为：上游引物：5’‑CATGGATTCGAACATGTTGAGATCGACCGTG‑3’下游引物：3’‑CCGAATTCTTCCTGCTCGTACCATTGGTTC‑5’。2CN116004744A说明书1/4页烟酰胺单核苷酸的制备工艺技术领域[0001]本发明涉及烟酰胺单核苷酸酶法生产技术领域，尤其涉及烟酰胺单核苷酸制备工艺。背景技术[0002]NMN的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、生物催化法。[0003]现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5′‑磷酸核糖基‑1′‑焦磷酸(PRPP)为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamidephosphoribosyltransferase，缩写成Nampt)的催化下制备NMN；但是，因PRPP的市场价格较高且来源受限，导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。[0004]在多种细胞代谢反应中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)分子都扮演着重要角色，是细胞保持活力的重要支撑。但随着年龄增长，NAD+水平会不断下降,细胞代谢能力也随之受到影响。虽然科学家已经发现细胞产生NAD+是始于前体分子烟酰胺单核苷酸(NMN)，但对于这种前体分子是如何进入细胞进而加工成NAD+的，却一直不清楚。[0005]研究发现，NMN转运蛋白会在钠离子的帮助下，将NMN直接运输到细胞中，并迅速发挥作用，用于NAD+的生产。[0006]但是发明人研究发现，针对老年生物体中，由于NMN的转运能力的减弱，从而导致老年生物体内转化NAD+效率降低。[0007]由此可见，烟酰