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本发明公开了一种结核分枝杆菌的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用,所述MNP标记组合包括AL123456基因组上MNP?1~MNP?17的标记,具体的核苷酸序列如SEQIDNO.1?SEQIDNO.17所示。所述引物对组合核苷酸序列如SEQIDNO.18?SEQIDNO.51所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定结核分枝杆菌并精细的区分不同的变种;所述引物互不干扰,综合多重扩增和测序技术,可一次性对多样本的所有标记组合进行序列分析,具有高通量、多靶点、高灵敏、高准确性和免培养的技术优势,可应用于大规模样本的结核分枝杆菌的精细鉴定、遗传变异检测和指纹数据库构建等,对结核分枝杆菌的监测、防治和科研具有重要意义。