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Westernblot实验技术原理WesternBlot采用是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记二抗。通过PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体起免疫反映，再与酶、荧光或同位素标记第二抗体起反映，通过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目基因表达蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平表达。WesternBlot按实验环节分重要涉及两某些：①SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（重要目为按分子量大小对蛋白质进行分离）；②Western印迹（在韧性支持物上通过抗原抗体杂交后显色强弱反映蛋白丰度）。1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：该技术一方面在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成具备网状立体构造凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可依照不同蛋白质分子所带电荷差别及分子大小不同所产生不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化样品中只具有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质氢键和疏水键，并按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷量远远超过其自身原有电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然电荷差别。因而，各种蛋白质SDS复合物在电泳时迁移率，不再受原有电荷和分子形状影响。这种电泳办法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDSPAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差别这一因素除去或减小到可以忽视不计限度，因而惯用来鉴定蛋白质分离样品纯化限度，如果被鉴定蛋白质样品很纯，只具有一种具三级构造蛋白质或具有相似分子量亚基具四级构造蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只浮现一条蛋白质区带。SDS—PAGE具备如下特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反映，在诸多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其敏捷度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，依照被分离物分子量选取适当浓度，通过变化单体及交联剂浓度调节凝胶孔径；(7)辨别率高，特别在不持续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高辨别率。实验模式图成果图2．Western印迹：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离后蛋白质，在电场中转移到固相支持物上（惯用硝酸纤维素滤膜）。而后以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体起免疫反映，再与酶或同位素标记第二抗体起反映，通过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目基因表达蛋白成分。转膜模式图杂交模式图二、实验准备一抗体选购流程（1）一方面拟定研究抗原分子正式及别用名，明确针对种属，明确除WB以外拟开展实验种类（如：FlowCyt，ICC/IF，IHC-Wmt，IHC-Fr，IHC-P，IP,）。（2）从惯用信誉较好公司网站查询符合（1）中规定抗体，国外公司涉及：Abcam，ABGENT，cellsignaling，Abnova，chemicon，novus，BD，epitomics。国内推荐：三鹰，中杉金桥，天德悦。仔细阅读抗体阐明书，需要考虑因素涉及：与否有文献已刊登，抗体效价，到货周期，抗体价格，单抗多抗，包装规格，抗体克隆号，并根据一抗种属选取相应二抗。（注意：普通国外抗体到货时间为3-5周，国内抗体3-5天）（3）订购成功后，定期与抗体代理公司联系，核算抗体状态并督促其及时到货。（4）收到抗体后，第一时间分装抗体避免重复冻融（置于冰上，推荐10ul每支分装并保存于-20℃）。妥善保管阐明书，建议打印一份放实验室，原版放办公室。（5）每批订购抗体至少保存5ul存底，用于重要实验验证。二抗选购流程二抗重要选取国内抗体，本实验室选取天德悦公司产品，使用者重要需考虑种属问题。样本制备（1）样本制备前需明的确验目，并依照下述实验办法选取适当实验体系，如：待检测蛋白所处位置（细胞浆，细胞膜，分泌蛋白等）（2）尽量保持细胞培养稳定性（即实验可重复性），如:细胞培养密度，更换培养液时间等。（3）如使用蛋白酶解决，也许会将目蛋白降解，同步还引入了新蛋白质从而干扰实验。因而建议解决贴壁细胞时，直接在培养瓶中加入裂解液，并用细胞刮进行收集。（4）蛋白质稳定，自从细胞破裂后，