Dellaporta法小量快速提取植物全基因组DNA.docx

Dellaporta法小量快速提取植物全基因组DNA前言该方法为QIAGEN的DNA提取试剂盒所采用，所以获得的DNA产量较低但质量相对于CTAB及Quick法高。推荐不喜欢CTAB法耗时耗力或无法保证Quick法结果的同学使用。该方法所得DNA可直接用于T-DNA的Genotyping及点突变的CAPS或dCAPS，若要用于ALM-PCR克隆未知基因，建议做步骤7（由于实验室现已使用Tiangen的DNA提取试剂盒，因此该方法不再建议用于克隆）。参考coldspringharborprotocols:DellaportaMiniprepforPlantDNAIsolation原文地址:http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/3/pdb.prot5178.abstract材料与试剂试剂：Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、SDS、醋酸钾、醋酸钠。提取缓冲液名称终浓度Tris-HCl（pH8.0）100mMEDTA-Na250mMNaCl50mMTris-HCl及EDTA-Na2通常配成1M、0.5M的母液，配置时稀释即可，100mL配制。BTEbuffer名称终浓度Tris-HCl（pH8.0）50mMEDTA-Na21mM20%（w/v）SDS：20gSDS加水定容至100mL5M醋酸钾：49.07g醋酸钾加水定容至100mL3M醋酸钠（pH5.2）：40.83gNaAc·3H2O溶解于80mLddH2O中，加冰醋酸至pH5.2，定容至100mL方法步骤取适当植物植物材料，液氮研磨至粉末状。加入500μl提取缓冲液，放置于冰上。加入35μl20%SDS，涡旋振荡混匀，65-70ºC水浴10min。加入130μl5M醋酸钾，摇动混匀，冰浴5min。20000g离心3min，EP管旋转180º后再离心3min；离心期间，准备新的EP管并加入640μl异丙醇及60μl3M醋酸钠备用。离心完成后转移上清至准备好的离心管中，轻摇混匀；20000g离心5min，弃上清。选作：加入200μlBTE缓冲液，重悬DNA沉淀；20000g离心3min，弃上清。加入700μl70%乙醇，洗涤两次，室温干燥。加水50或100μl溶解DNA。附录或说明步骤1中液氮研磨（枪头捣碎）可换用小杵在提取缓冲液中将叶片研碎，会更省时省力。步骤4的冰浴时间要求不严格，即便省去亦可（DNA产量有所减少）。步骤5中EP管旋转180º旋转是为了让沉淀聚于管底，方便吸取上清；不旋转亦可但适度延长离心时间。各步骤中的离心时间要求并不严格，通常3min足够将残渣（步骤5）或DNA（步骤6）沉淀。步骤8中洗涤一次亦可，但须保证晾干残余乙醇（乙醇会影响后续实验中），建议加入70%乙醇洗涤后放置一小会使DNA沉至管底，轻轻倒掉大部分乙醇，通常管底的大约100μl不会被倒出，然后离心将管壁上的残液离下，用黄色枪头吸去即可。步骤9中加水量根据自身情况确定，通常加水50μl时使用1-2μl做模板进行PCR或100μl时使用3-4μl。