提取植物基因组DNA的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105925564A(43)申请公布日2016.09.07(21)申请号201610325854.6(22)申请日2016.05.17(71)申请人北京百迈客生物科技有限公司地址101300北京市顺义区南法信府前街12号顺捷大厦5层(72)发明人郑洪坤刘慧宋军杨帆(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称提取植物基因组DNA的方法(57)摘要本发明涉及一种用于提取高完整度植物基因组DNA的方法。所述方法将植物组织在固定液中进行固定，用刀切成小段放置于细胞核分离液中用匀浆器搅拌，随后离心将大部分杂质与细胞核分离，并用percoll细胞分离混合溶液进一步进行核层分离，并最终将细胞核包埋于低熔点琼脂糖凝胶中，最后在胶块中进行蛋白、RNA等物质的去除。CN105925564ACN105925564A权利要求书1/1页1.一种提取高分子植物基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)将固定后植物组织与核分离液混合后利用匀浆器在30000-35000rpm的速度下匀浆处理30-40秒获得匀浆混合物，用孔径为80-100μm的滤膜过滤所述匀浆混合物，收集滤液并在2000g-2500g下离心15-25min，收集沉淀；(二)用核分离液重悬步骤(一)获得的沉淀，而后加入TritonX-100至TritonX-100终浓度为10-15体积％，获得重悬混合物，用孔径为20-40μm的滤膜过滤，将滤液部分加到percoll细胞分离混合溶液上方，600g-650g离心30-50min后将中间层及中间层下方1-2ml液体吸出获得核液；(三)用核分离液重悬所述核液后离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，将沉淀用核分离液重悬并在43-45℃水浴3.5-4.5min后与琼脂糖液混匀制胶块；其中，所述percoll细胞分离混合溶液的组成成分包括20-30体积％的核分离液和70-80体积％的percoll细胞分离液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中相对于每毫升的所述滤液部分，percoll细胞分离混合溶液的用量为1-1.5ml。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(一)中将固定后植物组织与核分离液按照1：8-12的质量体积比混合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核分离液的组成成分包括：10mM-15mMTris-HCL，10mM-25mMEDTA，100mM-150mM氯化钾，10mM-20mMNaCl，0.5mM-1.5mM精胺，0.5mM-1.5mM亚精胺，0.25-0.5体积％TritonX-100，2.5-7.5体积％M2-巯基乙醇和8-10％聚乙烯吡咯烷酮。5.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(一)包括，用清洗液清洗植物组织表面的杂质后用固定液接触固定获得固定后植物组织；所述清洗液的组成成分包括：10mM-15mMTris-HCL，10mM-30mMEDTA和100mM-150mMNaCl；所述固定液的组成成分包括：10mM-15mMTris-HCL，10mM-30mMEDTA，100mM-150mMNaCl和终体积百分含量为2％的甲醛。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(一)还包括先将所述固定后植物组织切成尺寸为2×2-3×3mm的小碎片后再与核分离液混合。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液对胶块进行孵育，再用EDTA溶液和TE溶液对胶块进行清洗获得清洗后胶块，用溶胶酶溶解胶块后透析获得植物基因组DNA。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的组成成分包括：0.8-1.5mg/ml蛋白酶K、0.5-1体积％M2-巯基乙醇，蛋白酶K缓冲液。9.根据权利要求1、2、6-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(四)48-52℃下用5-25倍体积的蛋白酶k溶液浸没胶块孵育12-24小时后在15-25℃下静置4-6分钟，静置结束后去除液体组分，用5-25倍体积的蛋白酶K溶液孵育1.5-2.5h，15-25℃下静置4-6分钟获得蛋白酶k孵育后胶块；(五)将所述蛋白酶k孵育后胶块在RNA酶溶液中孵育去除RNA获得RNA酶孵育后胶块。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，所述植物组织为植物新鲜幼嫩苗、叶片或幼嫩根尖部位。2CN105925564A说明书1/6页提取植物基因组DNA的方法技术领域[0001]本发明属于生物化学领域，具体的，涉及一种提取植物基因组D