CTAB法提取真菌基因组DNA.pdf

CTAB法提取真菌（霉菌、酵母）基因组DNA--试剂配制方法及操作步骤一、试剂配制（一）2%CTABB中液：1、各试剂终浓度：CTAB粉末——20g/L即10XTE（Tris-HClPH8.0——100mmol/LEDTAPH8.0——20mmol/L}NaCl——1.4mol/L2、配制方法：（1）配制1L:20gCTAB+100mlTris-HCt液（1m/L）+40mlEDTA母液（0.5m/L）+81.816gNaCl定容至1L。（2）配制100ml:2gCTAB+10mlTris-HC©液（1m/L）+4mlEDTA母液（0.5m/L）+8.1816gNaCl定容至100ml。（3）配置1XTE100ml10mlTris-HCl母液（1m/L）+4mlEDT如液（0.5m/L）（二）筑基乙醇分装1ml于离心管中2%CTAE^冲液与筑基乙醇以50:1体积混合。（三）Tris-苯酚、氯仿、异戊醇1、各试剂浓度：苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）2、配制方法：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合均匀即移入棕色玻璃瓶中4C保存。（四）NaAc和Nacl1、浓度：3mol/L2、配制方法：（1）3MNaAc10ml:称取2.46gNaAqpH4.0用ddH2O定容到10ml;（称量40.8gNaOAc.H2C®于烧杯中加入冰醋酸调节pH到5.2定容到100ml）;（2）5MNaCl100ml:称取29.22gNaCl用ddH2。定容到100ml称取292.2gNaCl置于1L烧杯中加入约800ml的去离子水后搅拌溶解加去离子水将溶液定容到1L后适量分成小份高温高压灭菌后4C保存。二、试验准备（一）1、周压1.5ml无核酸酶离心管Xn个样品、2ml、5ml离心管；2、高压超纯水500ml（去离子水）用于试剂配制；3、枪头10小200小1000U；（二）1、筑基乙醇10UX企样品分装于2ml管；2、Tris-苯酚500X命样品分装于5ml管；3、氯仿480MX企样品分装于5ml管；4、异戊醇20UX企样品分装于5ml管；5、70%乙醇1.2mlX个样品分装于5ml管；6、水浴锅65C预热、37C预热；7、NaAc150UX企样品分装于5ml管；8、-20C预冷无水乙醇1.1mlX个样（或异丙醇）800UX企样品、氯仿异戊醇（24:1）500X命样品；9、RaseA酶（10mg/ml）解冻；二、试验步骤1、2%CTA累解液500UX企样品放于65C水浴锅中预热；2、真菌悬液离心得到大约100mg真菌组织于2.0mL离心管；3、10MX命样品筑基乙醇加到预热的2%CTAE®解液中；4、每个样品中加510UCTAB和筑基乙醇混合液100mg玻璃珠旋涡震荡研磨裂解30min或以上（裂解一定要彻底）；5、放入65C水浴锅中保温30~60min期间轻摇数次（一般20min左右一次刚投入水浴时可以稍快速的晃动之后的晃动一定要轻柔）。6、加入5--10^1（试剂盒用10QIRNaseA（RNaseA提前拿出融化）10C离心升至4000rpm即停使RNaseA^溶液充分混合。7、37C水浴消化1h-2h（或过夜）。8、从水浴锅中取出样品管加入体积的Na